依泽替米贝对非酒精性脂肪肝病细胞模型脂质沉积和凋亡的影响及其与自噬关系的研究

宋 琪，吴鹏波，谭诗云

(武汉大学人民医院消化内科 消化系统疾病湖北省重点实验室，武汉 430060)

非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是西方国家慢性肝病最常见的病因，预计也将于2030年成为肝移植最常见的指征[1]。自2001年以来，NAFLD已成为世界上慢性肝病的主要病因，由其病程进展可分为单纯性肝脂肪变、非酒精性脂肪肝炎及肝纤维化[2]，其发病机制复杂多样，包括胰岛素抵抗、脂肪细胞激素分泌、肠道微生态改变、营养因素和遗传因素等[3-5]。肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病和血脂异常是NAFLD最重要的危险因素[6]。在全球范围内的成年人中，NAFLD的发病率已高达20%～40%[7]。

依泽替米贝(ezetimibe,Eze)作为一类新型的选择性胆固醇吸收抑制剂，已有多篇文献报道了它联合他汀类药物对血清胆固醇水平的降低作用[8-10]。Patel等[11]的研究也表明Eze可改善伴有肝功能损害的NAFLD患者血清胆固醇及肝功能水平。体内研究发现Eze可抑制肠道和肝脏的胆固醇吸收靶点NPC1L1(Niemann-Pick C1-Like 1)，从而降低食物中胆固醇的吸收、降低肝脂肪含量及改善肝脏胰岛素敏感性等，进而起到治疗NAFLD的作用[12]。

自噬，即细胞自我消化，是细胞内的溶酶体降解细胞内受损的细胞器、未折叠的蛋白质和细胞内的病原体的代谢过程[13-14]。Lee等[15]研究表明，Eze可通过激活Nrf2对高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝炎小鼠起到一定的治疗作用，而这个过程与自噬相关蛋白p62密切相关。本实验以油酸(oleic acid,OA)诱导HepG2细胞为体外模型[16]，探讨Eze对NAFLD细胞模型脂质沉积和凋亡的影响及其与自噬的关系，为Eze治疗NAFLD提供实验依据。

1 资料与方法

1.1一般资料

1.1.1细胞株和试剂 人肝癌细胞株HepG2由武汉大学中南医院赠送。Eze购于上海阿拉丁生物公司(产品编号:E126609)；Gibco DMEM/H(Dulbecco′s modified eagle medium/high glucose)培养液购自美国赛默飞世尔公司，NQBB胎牛血清购自澳大利亚Bolise Co.,Ltd.公司；细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)试剂盒、苏木精染液、Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG、膜联蛋白-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(annexin V-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide annexin,V-FITC/PI)凋亡检测试剂盒和辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG购自上海碧云天生物公司；油红O、β-肌动蛋白(β-actin)购于北京索莱宝科技有限公司，OA购于美国Sigma公司(货号:O1383)；Beclin-1和微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light 3，LC3)抗体购于美国Cell Signaling Technology公司；质粒购于上海海吉浩格生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购于北京康为世纪有限公司。

1.1.2仪器 THERMOHeracellVIOS 160i/250i CO2培养箱(德国Thermo Scientific公司)，Bio-Rad imark全自动酶标仪，Bio-Rad凝胶成像系统ChemiDocTMXRS+，OLYMPUS IX71显微镜，OLYMPUS BX53显微镜，Bio-Rad电泳仪，流式细胞仪BD FACS Calibur。

1.2方法

1.2.1细胞培养 从液氮罐中取出HepG2细胞冻存管，置于37 ℃恒温水浴中于1～2 min内迅速解冻，以离心半径8 cm，1 000 r/min离心4 min后去除冻存液，并用含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM完全培养基重悬后移至细胞培养瓶中，置于37 ℃、含5% CO2的细胞培养箱中培养。隔日换液，3～5 d后传代，取处于对数生长期的细胞进行实验。

1.2.2CCK-8实验 取对数生长期的HepG2细胞，用完全培养基调整细胞浓度为5×104/mL，接种于96孔板中，每孔加入100 μL细胞悬液置于培养箱中培养。次日按照每组3个复孔及培养板顺序进行分组给药，分为空白对照组、OA组(OA浓度为0.6 mmol/L)、Eze低浓度组(Eze浓度为10 μmol/L)、Eze中浓度组(Eze浓度为20 μmol/L)、Eze高浓度组(Eze浓度为40 μmol/L)，药物处理36 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育1 h用酶标仪在 450 nm测定吸光度。增殖率=A实验组/A空白组×100%。

1.2.3油红O染色 取对数生长期的HepG2细胞，将细胞浓度调整为5×104/mL，接种于24孔板中，每孔加入1 mL细胞悬液进行培养。次日按照是否加入OA、Eze和氯喹(chloroquine,CQ)及培养板顺序进行分组给药，分为空白对照组、OA组、OA+Eze组及OA+Eze+CQ组，其中各药物浓度分别为OA浓度为0.6 mmol/L，Eze浓度为20 μmol/L，CQ浓度为20 μmol/L。药物处理24 h后，每孔用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)洗涤3次，4%多聚甲醛固定30 min，再次用PBS洗涤3次，每孔加入500 μL油红O染液(提前用双蒸水以2∶3比例稀释0.5%油红O溶液，混匀后静置30 min，并用直径为0.22 μm的微孔滤膜过滤)，于37 ℃水浴箱中染色1 h，用75%乙醇洗涤5 s后以苏木精染核，甘油明胶封片，倒置显微镜下观察脂滴沉积情况。

1.2.4Western blot检测Beclin-1和LC3表达水平 取对数生长期的细胞接种于6孔板中，每孔加入2 mL完全培养基进行培养。次日分组给药(分组同油红O染色)，药物处理24 h后提取细胞蛋白，并用BCA蛋白浓度试剂盒测定蛋白浓度，根据测得浓度调整上样量，将蛋白样品加入十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，后经电泳、转膜、封闭，Tris-HCl+Tween-20缓冲盐溶液清洗3次(每次5 min)，在一抗溶液中4 ℃孵育过夜，Tris-HCl+Tween-20缓冲盐溶液清洗3次(每次15 min)后于二抗中37 ℃孵育1 h，TBST清洗3次(每次15 min)，用ECL化学发光液浸润1 min，于凝胶成像系统中扫描成像并计算灰度值。

1.2.5细胞凋亡实验(Annexin V-FITC/PI双染) 将对数生长期的细胞用胰酶消化后重悬于完全培养基中，然后接种于6孔板中进行培养。次日分组给药(分组同油红O染色)，24 h后，用胰酶消化细胞并洗涤3次，用结合缓冲液重新悬浮细胞，加入5 μL Annexin V/FITC 和10 μL浓度为20 μg/mL的PI溶液，混匀后于室温避光孵育15 min，后在反应管中加400 μL PBS，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.6免疫荧光染色 将对数生长期的HepG2细胞按照每孔2.5×104个细胞接种于24孔板中，接种前与24孔板内放置无菌细胞爬片，每孔加入1 mL完全培养基，置于细胞培养箱中培养。次日分组给药(分组同油红O染色)，24 h后进行细胞固定和封闭，操作步骤如下：将细胞用PBS洗涤3次，4%多聚甲醛固定30 min，再次用PBS洗涤3次，免疫荧光通透液通透5 min，PBS洗涤3次，用山羊血清封片30 min。然后加入一抗，4 ℃孵育过夜，PBS洗涤3次，加入Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG，PBS洗涤3次，用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染核5 min，PBS洗涤3次，取出细胞爬片，抗荧光淬灭剂封片，在正置显微镜下以495 nm为激发波长观察细胞LC3表达情况。

2 结 果

2.1Eze对HepG2细胞增殖活性的影响 OA组、Eze低浓度组、Eze中浓度组、Eze高浓度组细胞增殖率分别为(0.829±0.048)%、(0.845±0.105)%、(0.864±0.086)%、(0.796±0.109)%，各组比较差异无统计学意义(F=0.202，P=0.892)。

2.2油红O染色结果 OA+影响Eze组脂滴含量明显低于OA组，加入自噬抑制剂CQ后，OA+Eze+CQ组脂滴含量明显高于OA+Eze组，Eze对OA造模的HepG2细胞内脂滴含量的影响见图1。

a:CON；b:OA；c:OA+Eze；d:OA+Eze+CQ

2.3Eze对HepG2细胞Beclin-1和LC3表达的影响 各组HepG2细胞Beclin-1和LC3表达水平比较差异有统计学意义(P<0.05)，其中OA+Eze组Beclin-1/β-actin和LC3Ⅱ/β-actin表达高于OA组(P<0.05)，OA+Eze+CQ组Beclin-1/β-actin低于OA+Eze组(P<0.05)，OA+Eze+CQ组LC3Ⅱ/β-actin高于OA+Eze组(P<0.05)，见表1。Eze对HepG2细胞Beclin-1和LC3表达水平的影响，见图2。

表1 各组HepG2细胞Beclin-1和LC3表达水平的比较

CON：空白对照；OA：油酸；Eze：依泽替米贝；CQ：氯喹；Beclin 1：Beclin-1蛋白；LC3：微管相关蛋白1轻链3；β-actin：β-肌动蛋白；a与OA组比较，P<0.05；b与OA+Eze组比较，P<0.05

CON：空白对照；OA：油酸；Eze：依泽替米贝；CQ：氯喹；Beclin 1：Beclin-1蛋白；LC3：微管相关蛋白1轻链3；β-actin：β肌动蛋白

图2 Eze对HepG2细胞Beclin-1和LC3表达水平的影响

2.4细胞凋亡实验检测结果 空白对照组、OA组、OA+Eze组、OA+Eze+CQ组细胞凋亡率分别为(0.820±0.083)%、(2.777±0.114)%、(1.673±0.094)%、(5.710±0.109)%，各组比较差异有统计学意义(F=109.397,P<0.05)。OA组细胞凋亡率高于空白对照组(P<0.05)，OA+Eze组细胞凋亡率低于OA组(P<0.05)；OA+Eze+CQ组细胞凋亡率高于OA+Eze组(P<0.05)。Eze对OA造模的HepG2细胞凋亡率的影响，见图3。

2.5免疫荧光染色结果 与空白对照组比较，OA组LC3表达水平无明显变化，加入Eze后，Eze+OA组LC3表达水平相较于OA组均升高，加入CQ后，LC3表达水平相较于Eze+OA组升高，Eze对油酸造模的HepG2细胞LC3表达水平的影响见图4。

3 讨 论

近年来NAFLD发病率不断增高，却仍缺乏安全有效的治疗药物，本研究致力于在细胞水平上探讨Eze对NAFLD的治疗作用及其机制。通过OA造模，模拟出NAFLD的细胞模型，从油红O染色的结果可以看出，Eze可显著降低细胞模型中脂滴含量，这与Patel等[11]的研究结果一致，提示Eze可改善NAFLD时肝细胞内脂质沉积。而在加入自噬抑制剂CQ时，其改善脂质沉积的效果降低，提示其改善脂质沉积的机制与自噬有一定的相关性。

CQ作为一种传统的抗疟药，近年来多项研究表明对多种晚期肿瘤具有一定的治疗效果[17-20],其抗肿瘤作用正是通过阻碍自噬实现的[21]。CQ含有的疏水性弱碱基，在其扩散到溶酶体后被捕获并质子化，导致溶酶体内pH值上升，从而阻碍自噬体和溶酶体结合成自噬溶酶体进而降解的过程，在自噬晚期阻碍自噬的发生、发展[22]。LC3Ⅱ及Beclin-1作为普遍承认的自噬相关蛋白，LC3Ⅱ/β-actin及Beclin-1水平的增高提示自噬水平升高[23]。CQ对自噬的阻碍作用表现在LC3Ⅱ/β-actin水平的增高及Beclin-1水平的降低。Western blot的结果提示，相对于OA组，加入Eze后细胞自噬水平明显升高，加入Eze和CQ后细胞自噬水平降低，表明Eze可增强非酒精性脂肪肝细胞的自噬，而自噬抑制剂CQ表现出对自噬的显著抑制效果。同时，通过LC3B的免疫荧光染色检测也与Western blot的结果一致，提示Eze可增强非酒精性脂肪肝细胞的自噬，加入CQ后自噬水平下降。

在NAFLD的初始阶段，细胞内出现过多的脂质积聚和脂肪变性，进而通过氧化剂或细胞因子损伤肝细胞，使疾病进展为非酒精性脂肪肝炎[24-25]。促进自噬对肝细胞脂滴沉积减少可能与细胞自噬体的代谢功能相关，自噬体含有降解细胞器相关脂质和外源脂蛋白的脂肪酶，促进自噬有助于促进自噬体和溶酶体的融合及其脂质的分解[24]。Eze在升高细胞内自噬水平的同时降低了细胞内脂质沉积水平，且这种作用在加入自噬抑制剂CQ后被抑制，因此，推测Eze可通过增强NAFLD细胞模型自噬水平减少细胞内脂质沉积。

CON：空白对照；OA：油酸；Eze：依泽替米贝；CQ：氯喹；Beclin 1：Beclin-1蛋白；LC3：微管相关蛋白1轻链3；DAPI：4′,6-二脒基-2-苯基吲哚；MERGE：合并

本研究中，加入Eze可明显改善OA诱导NAFLD细胞模型的细胞凋亡率，而加入自噬抑制剂CQ后，其凋亡水平又明显增加，表明Eze可减轻NAFLD细胞模型的细胞凋亡率，自噬抑制剂CQ可在一定程度上逆转这种效果。Schleicher等[26]研究表明细胞内脂质沉积减少后，脂肪变性状态的细胞可以被逆转成为健康细胞。在NAFLD中，细胞脂质沉积是导致细胞脂性凋亡的最主要原因[27]，本研究中Eze既降低了细胞内脂质沉积水平，又减少了细胞的凋亡率，因此，推测Eze通过增强细胞自噬水平减少NAFLD细胞模型中的细胞凋亡。

综上所述，Eze在增强细胞的自噬水平的同时，减轻细胞内脂质沉积并明显减少细胞凋亡的发生，且这种效果在CQ显著抑制自噬后被逆转，因此，说明Eze可能通过增强非酒精性脂肪肝细胞的自噬水平降低NAFLD细胞模型脂质沉积和凋亡发生,因此可能对NAFLD具有一定的治疗效果。