心脏发育过程中的分子调控

吴 铮 许栋明 孙芳玲 刘婷婷 郭德玉 艾厚喜 王 文

据WHO统计，2012年我国引起死亡的十大疾病中，缺血性心脏病位居第2位，并呈逐年上升的趋势。而目前已知的是，心肌梗死的病理机制是由于严重冠状动脉粥样硬化堵塞冠状动脉管腔，而导致心肌细胞长时间处于缺血、缺氧状态下而引起细胞坏死，而缺血坏死的心肌细胞会引起心脏重构等结构变化，最终患者因不可逆的心肌梗死而引起心力衰竭导致死亡。但目前已知的治疗心肌梗死的方法很有限，基本上是急性心肌梗死后引起患者出现症状后的介入治疗，或口服药物预防心肌梗死的发生；而传统的药物治疗是针对左心室功能紊乱的机制来进行调节，并不能够彻底解决心肌细胞坏死的根本问题[1]。

目前，人类心肌组织的再生仍然是作为治疗心血管疾病主要的研究目标。人们曾一度认为成熟的心肌细胞不具备再生的能力，但是近些年研究发现一些鱼类和两栖动物可以在心肌受损后自行再生，新生鼠在出生后1周内也有这种再生修复能力[2，3]。也发现成年鼠在心肌梗死后也有少量的心肌细胞出现再生现象，虽然过程缓慢并不能够完全弥补心肌梗死后大量心肌细胞的丢失。经cre-loxp方法追踪发现，这些少量再生的心肌细胞可能来自于祖细胞池。为了能够证实发生心肌梗死后的心脏可能会激发内源性心脏祖细胞分化成新的心肌细胞，关键是要更深入了解心肌细胞从胚胎分化和增殖的分子机制。本文主要将在心脏发育过程中一些相关分子的调控作用进行综述，以及为研究心脏受损后的心肌细胞再生提供一定的理论基础。

一、心脏的发育过程

小鼠心脏发育开始于胚胎发育第7.5天，这个时期(即原肠胚时期)胚胎有内胚层、中胚层和外胚层3个胚层，心脏组织大部分是从中胚层发育而来。由于胚胎的折叠作用导致生心区形成，第一生心区的心脏祖细胞增殖逐渐发育成线性心管。随着心脏发育进行，心管的头端逐渐与动脉极相连，尾端与静脉极相连，到胚胎第9天整个心管开始发生弯曲。在弯曲的过程中，心管各段的细胞生长速度不同，导致心管膨大出心球、心室、心房和静脉窦4部分，同时开始从静脉极向动脉极泵血。紧接着房室在食管的压制下，逐渐扩大形成原始的左心室和右心室。几乎在胚胎第11.5天之后心肌细胞大量增殖，心脏内部开始分隔，逐渐形成4个腔室，心室壁在发育过程中出现心肌小梁，随着心肌细胞增殖又逐渐消失直至出生[4]。

另外，脊椎动物心脏表面还覆盖着与心肌细胞不同的一类组织：心外膜。心外膜不是一群简单的同源细胞，在心脏发育过程的重要性常被忽视。人们一度认为心外膜是心包的一部分，起源于心肌细胞，直到19世纪60年代才对其有所发现并更正此观念。小鼠胚胎第8.5天，前心外膜(proepicardium，PE)坐落在近静脉窦的位置，接着迁移至心脏表面，附着后增殖，形成一层外膜结构包裹心脏[5]。心外膜虽与心肌细胞同时来自中胚层的分化，但是心外膜细胞本身具有分化能力，它可分化成平滑肌细胞、成纤维细胞或间充质干细胞，而心外膜细胞的分化能力可能会成为心肌梗死后心脏有能力再生的关键性线索[6]。

二、心脏发育过程中的分子调控

1.生心区形成的分子调控：心脏发育的第一步是原条细胞的T-box转录因子Eomesodermin(Eomes)激活BHLH转录因子——心脏特化起始标志物Mesoderm Posterior 1(Mesp1)，而这些原条细胞融合在中线靠近前肠的位置并形成生心区[7]。Mesp1可以通过细胞外基质中的因子FGFs、VEGFs和PDGFs激活Mesp1-RasGRP-ERK信号，以调节心脏前体细胞的迁移[8]。在心脏特化过程中Mesp1的调节是多面性的，既可促进心脏特化又可保持细胞多潜能性。心脏前体细胞转移到生心区后，下调Mesp1和其家族的Mesp2激活转录因子来促使心脏进行分化。

心脏发育过程中还有一些信号通路决定了生心区的形成，包括来自前肠内胚层的促生心信号和来自中线以及神经板的抗生心信号，这些因子决定生心区大小以及形状。促生心因子有Hedgehog、骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)、成纤维生长因子(fibroblast growth factors，FGFs)和非经典Wnt/JNK通路[9]；抗生心因子有经典Wnt信号通路、脊索分泌的BMP拮抗剂Noggin和Chordi[4]。

2.第一生心区和第二生心区的发育的分子调控：生心区包括第一生心区和第二生心区，最早表达Mesp1的前体细胞构成第一生心区(first heart field，FHF)——最初的生心区，而来自咽喉中胚层的Mesp1阳性前体细胞构成第二生心区(second heart field，SHF)[10]。相对FHF而言SHF的细胞增殖能力更强，但分化却相对缓慢。FHF已经开始增殖分化并逐渐形成心管；而SHF仍处于未分化祖细胞的状态。随着心管的发育，静脉极和动脉极逐渐形成，SHF的多功能祖细胞才迁移至静脉极和动脉极参与心脏的发育。鼠的胚胎中FHF细胞主要分化构成左心室和心房的一部分， SHF细胞分化构成右心室、心房，流入道和流出道[11]。

FHF和SHF细胞表达的基因决定了其分化的早晚。FHF细胞表达Tbx5及HCN4和Nkx2.5[12, 13]。SHF细胞特异性的表达LIM同源转录因子Islet1和转录因子Tbx1，以及生长因子Fgf8和Fgf10。

经典Wnt /β-catenin激活鼠胚胎中SHF细胞的Islet1表达，同时保持Islet1阳性祖细胞分化潜能的稳态[14]。Islet1调节咽喉内胚层表达Shh，促进SHF细胞增殖。Shh也是SHF发育过程中很重要的分子，研究发现敲除Shh表达后会引起SHF细胞的缺失，最终导致右心室和流出道发育不全[15]。Shh促使Tbx1激活Fgf3、Fgf8和Fgf10，而Fgf8可以促进SHF发育，消融Fgf8心脏无法形成右心室或者流出道[16]。

3.心腔形成的分子调控：形成线性心管的心肌细胞被称作初级心肌，它们有增殖速度慢、自律性有限、传导性以及收缩性差的特性[17]。在心脏形成内部结构的初期，初级心肌未表现出增殖的形态，但是心管开始向外部扩张之后，初级心肌细胞就开始增殖分化并形成心房和心室的细胞。心管的蠕动可促使心脏形成的进程，同时心内膜和心肌细胞也根据血流动力的驱使以及心脏收缩方式改变着它们细胞的形态并且影响细胞增殖的速度，最终心房以及心室细胞构成腔室的结构，也具有了其细胞的特性，包括细胞的兴奋性、自律性、传导性和收缩性。

参与调节心腔形成的因子包括T-box的转录因子Tbx2、Tbx3、Tbx5、Tbx20以及Nkx2.5、Gata4、Cited1、Irx4、Irx1/Irx3/Irx5和Hand1[11]。各个转录因子在不同心肌细胞中表达不一。其中，T-box的表达模式比较狭窄，相比较Nkx2.5和Gata4表达在整个心管中，Tbx5只在流入道和初级心房中有较高的表达，在初级心室中表达相对较少，而在流出道中不表达；Tbx2和Tbx3相比较Tbx2表达量更大，它们在流出道、内部的结构、房室的管道和流入道的初级心肌中均有表达；而Tbx20在心管中广泛表达[18，19]。Tbx5和Tbx20能够结合Nkx2.5及Gata4通过诱导心房利钠肽因子Nppa、连接蛋白connexin40和connexin43以及细胞骨架蛋白Chisel，促进心腔心肌细胞表达特异化[20]。Tbx5与Nkx2.5结合还可通过调节转录抑制因子Id2的表达，来调节左右心室肌束结构的形成[21]。与Tbx5和Tbx20不同，Tbx2和Tbx3也可以与 Nkx2.5和Gata4相互作用，达到抑制心腔增殖和特异性分化的作用，最终影响心腔的形成[11]。有研究发现，通过在小鼠体内对Tbx2过表达会可导致Tbx20表达的缺失，进而影响了心腔的发育[19]。转录因子Tbx3主要的功能是通过抑制窦房连接部位的细胞表达HCN4，而影响心脏窦房结的形成[21]。

心脏发育过程中形成的4个腔室，每个腔室的心肌表达基因并不完全相同。在小鼠的心房中通常表达MLC2a，而在心室中则表达MLC2v，其中左心室表达eHAND，右心室中表达dHAND[11]。在心房发育时，左心房高表达Pitx2，会抑制Shox2，导致窦房结发育受抑制进而阻止了异位起搏点的分化[22]。而在鸡发育过程中，两个腔室均表达Irx4，它是通过激活心室肌球蛋白MHC1而达到抑制心房表达MHC197，鸡胚中右心室表达Tbx20，而左心室不表达Tbx20[23]。

4.心室心肌小梁发育的分子调控：在左右腔室形成后心肌细胞开始明显增殖，结果分隔形成4个腔室，室壁扩增直至最后完成心脏的发育。在这个过程中心肌细胞从心外膜下层增殖形成一个收缩束样的网状组织，称为网状心肌小梁。心肌小梁细胞在结构上与内皮组织类似，心肌小梁多见于心室而少见于心房，并在冠状血管发育前为心脏提供能量和氧气。紧接着，心外膜下层心肌细胞增殖快于内层心肌细胞并呈现一种更小更致密的形态，这个过程称为心室致密化，心室致密化一直持续到出生。在此期间，冠状血管结构逐渐发育，心肌增殖能力逐渐减弱，在出生时致密的心肌几乎包含整个左心室。

穿膜受体Notch1是心内膜与心肌相互调节最主要的受体，当心内膜细胞外的Notch结合Delta4和Jagged之后，其在心内膜细胞内的部分(notch intracellular domain，NICD)会断裂开转移至细胞核与转录抑制因子RBPJK结合，并上调BMP10达到激活细胞增殖的作用。在沉默rbpjk的小鼠心内膜中的EphrinB2和神经调节蛋白(neuregulin1，NRG1)表达量均下降，小梁发育时NICD1激活EphrinB2，而EphrinB2可促进NRG1表达，从而介导心肌细胞增殖[24]。NRG1是心内膜生长因子，与酪氨酸蛋白激酶受体ErbB4结合后和ErbB2形成二聚体，激活信号传递介导细胞生长和迁移[25]。沉默Tbx20的小鼠不能够形成小梁，并会在胚胎发育10.5天死去，说明Tbx20主要的作用是促进心肌细胞分裂和小梁的形成而不是心脏祖细胞前期的分化[4]。

在心管形成后，心内膜和心肌层之间形成一层很厚的细胞外基质，称为心胶质，心胶质对心肌小梁的增殖和心脏发育起到关键的作用。室间隔形成时心内膜和心肌的Has-1编码生成透明质酸，Vcan编码生成多功能蛋白聚糖versican，小鼠体内如果缺少这两者则不能生成小梁，也会导致室间隔缺失[26]。整合素样金属蛋白酶与凝血酶Ⅰ型结合蛋白(ADAMTS1)和共作用因子Fibulin-1能裂解versican影响心胶质的降解，心胶质降解的同时小梁增殖逐渐衰退；缺少Fibulin-1的小鼠ADAMTS1活性减弱，导致小梁过增殖同时心室致密化不能进行[27]。此外， Integrin β1与Integrinα可以形成异质二聚体，之后与成纤维细胞的纤连蛋白和胶原结合，促进心肌细胞增殖，其中成纤维细胞主要分布在致密部分； Integrin β1沉默的心肌细胞在致密化过程中的心肌细胞增殖速率明显下降[28]。

三、心外膜发育的分子调控

小鼠的心外膜来自前心外膜细胞，PE最开始是菜花样体腔细胞簇，它们向着心包腔指状突出，随着发育进行这些细胞聚集在心脏流入道后方，覆盖横隔。当PE接触到心肌层，它们开始平铺伸展成鹅卵石样单层上皮，逐渐长满整个心脏形成固定空间结构，即为初级心外膜。

Fgf8/Snai1可以调节前心外膜细胞最原始的发育，Fgfs能够促进PE增殖同时保证PE不分化成心肌细胞。BMP2的低表达也能够维持PE的特性通过促进Tbx18和Wilms肿瘤抑制蛋白(wilms tumor suppressor protein，Wt1)表达，然而高表达BMP2则诱导PE向心肌分化，抑制BMP信号能降低PE标志物Tbx18和Tcf21的表达。研究小鼠胚胎发现Integrinα4和血管黏附分子1(vascular adhesion molecule 1，VCAM-1)可稳定心外膜黏附于心肌层，并且使心外膜细胞在心脏表面迁移，靶向使VCAM-1或者Integrin 4失活会损坏心外膜和冠状动脉的形成。

在PE形成初级心外膜后，一些心外膜上皮细胞向间充质细胞转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)后侵入到心肌层，为发育中的胚胎结构提供间质细胞。Wt1是这一过程中关键的调节因子，最早在小鼠胚胎9.5天的PE中表达，随着发育的进行，Wt1开始表达于室间隔、左心室和右心室中，并且表达于心外膜的衍生细胞包括纤维细胞、平滑肌细胞以及内皮细胞中，但是否表达于心肌细胞和心内膜细胞中目前还存在争议。Notch1信号通路在这一过程中促进血管祖细胞穿过致密的心肌细胞，这些细胞可以分化成心脏成纤维细胞、冠状动脉血管平滑肌细胞。Wnt/β-catenin信号通路是EMT中重要调控因子，Wt1促进β-catenin和Lef1在心外膜中表达；相反，β-catenin缺失也会导致Wt1缺失，最终导致冠脉发育不全以及EMT不可进行。而维甲酸也调控着心脏发育及形态变化，并在Wt1缺失的心外膜细胞中Raldh2的表达降低，维甲酸合成也减少[6]。

目前也有一些研究发现心外膜细胞对于心肌梗死有一定的修复作用，如心外膜过表达Fstl1蛋白可以刺激细胞进入细胞周期，改善心肌梗死后心脏功能。在心肌梗死前注入胸腺素β4可以使部分成年鼠的祖细胞表达Wt1，使其具有成血管潜能；IGF1R可以调节心梗后Wt1细胞的EMT。然而目前人们对这些问题还有争议，还需要进一步的研究探讨。

四、展 望

心脏发育是胚胎发育中很重要的一个阶段，其中的发育机制错综复杂，正逐步地被人们所探究发现。本文通过对心脏发育中大致的进程总结了相关分子的调控机制，希望可以对探索治疗缺血性心脏病提供一定的启示作用。因为缺血性心脏病严重危及患者生命，目前对于心肌细胞能否再生成为研究的重点。虽然目前体外细胞移植可以改善心脏功能，但收效有限，且没有从根本上解决心肌受损这一问题，而且将其真正全面应用到心肌梗死的治疗还需要进一步的改进。然而，还有一些问题目前还未得到证实，如心外膜细胞能否在心肌梗死发生后发挥其转化作用，从而使其可转化生成新的心肌细胞；还有心肌梗死后内源性祖细胞的变化能否通过信号通路中的分子过表达或沉默而生成新的心肌细胞，这些都可能会为缺血性心脏病的治疗提供一些可能性。