lncRNA与miRNA相互调控作用机制及其在胃癌中的影响

陈为凯 张亚男 于建平 汪文杰 余稳稳 徐子鹏 韩博强 刘宏斌

胃癌(gastric cancer，GC)是全球第二大癌症相关死亡原因,占全球恶性肿瘤死亡人数的8.8%[1]。在中国，2014年GC的病死率为21.48/105，约29.4万人，位居第3位[2]。亚洲是GC高发地区，最新数据显示，在2000～2014年我国GC5年生存率仍低于40%[3]。随着基因芯片技术的广泛应用，人类基因组中仅不到2%的基因具有编码功能，非编码基因已获得广大专家学者的高度重视。非编码微小RNA(micro noncoding RNA，miRNA)和长链非编码RNA(long nocoding RNA，lncRNA)已成为肿瘤领域的研究焦点。近年来，多项研究表明，二者不仅分别在肿瘤疾病的发生、发展中发挥重要作用，其间还存在诸多交叉调控。为探讨lncRNA与miRNA相互调控作用及其在GC中的影响，通过查阅文献，现综述如下。

一、lncRNA与miRNA的相互调控作用

1.miRNA促进lncRNA的衰减：在细胞中，miRNA可靶向调控lncRNA，通过降低lncRNA的稳定性而造成其衰减。众所周知，miRNA是通过与其靶基因直接结合，进而诱导靶基因降解和(或)抑制其翻译过程。Chen等[4]研究表明，在食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)中，lncRNA-let与miR-548k的表达呈负相关,miR-548k可直接靶向抑制lncRNA-let的表达，进一步下调p53和上调NF90的表达。miR-548k的高表达与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移、TNM分期及患者生存率显著相关。miR-548k能促进体外培养的ESCC细胞增殖和迁移，促进肿瘤的体内生长，而miR-548k对ESCC的影响则依赖于其对lncRNA-let的直接结合并抑制lncRNA-let的表达。同样在ESCC中，Wang等[5]利用RNA纯化-qPCR法分离染色质，发现miR-196A能与lncRNA Gas5结合。同时荧光素酶报告分析表明miR-196A可与lncRNA Gas5的第7外显子结合，且Gas5和miR-196A都能与RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)的关键成分Ago 2结合。提示Gas5在ESCC中起抑癌基因的作用，并受miR-196A参与RISC的调控。在此之前，多项研究证明在各种病理生理过程中均存在miRNA诱导的lncRNA表达抑制，包括lncRNA p21、lncRNA HOTAIR、lncRNA MALAT1、lncRNA LOC85194、lncRNA PTTCC3及lncRNA H19等，提示miRNA对lncRNA的抑制机制可能是广泛存在的[6～8]。

2.lncRNA作为miRNA海绵/诱饵:与编码RNA共享miRNA反应元件(microRNA response elements，MRE)的lncRNA可能存在类似的miRNA靶向序列，竞争性抑制miRNA与mRNA间的相互作用。这些lncRNA被称为竞争性内源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)，可以作为miRNA的“海绵”或“诱饵”，减少可用miRNA的数量，并有利于提高目标mRNA的翻译。近来，Zhou等[9]在探索lnc HAND 2-AS1在结直肠肿瘤性疾病的作用时，通过生物信息学方法发现lnc HAND 2-AS1与miR-1275形成互补碱基。在HCT116细胞系中，lnc HAND 2-AS1过表达可明显抑制miR-1275的表达。此外，miR-1275的高表达抑制了lnc HAND 2-AS1的表达，而抑制miR-1275的表达则促进了HCT 116细胞lnc HAND 2-AS1的表达。为验证lnc HAND 2-AS1是否与miR-1275相互作用，研究者其采用荧光素酶报告法，发现转染miR-1275可以降低pmirGLO-HAND 2-AS1-WT在HCT 116细胞中的荧光素酶强度。此外，qRT-PCR分析显示lnc HAND 2-AS1与miR-1275在大肠癌组织中的表达呈负相关。此研究表明lnc HAND 2-AS1在结直肠肿瘤细胞中中充当miR-1275海绵。Wang等[10]也使用类似实验方法发现，lncRNA HOXA-AS2同样作为ceRNA调控miR-520c-3p的表达。

3.lncRNA/miRNA与mRNA的竞争性结合:非编码RNA的调控机制与蛋白质编码RNA一样复杂。一方面，非编码RNA可能受到多种机制的调控，如基因突变、DNA拷贝的改变、转录缺陷和表观遗传改变等。例如，lnc BACE1AS可以与miR-485-5p竞争，通过拮抗miR-485-5p诱导的mRNA降解来抑制lnc BACE 1的表达下降[11]。同样，在使用抗肿瘤药抑制宫颈癌HELA细胞内源性let-7i后，另一种lncRNA Hox反义RNA(HOX antisense intergenic RNA，HOTAIR)仍是富集、稳定的[12]。Franklin等[13]研究发现，长链非编码N-ras功能性RNA(NCNRFR)可与let-7竞争性结合含有let-7位点的mRNA，同时也逆转了let-7对mRNA的抑制作用。Faghihi等[14]在β-淀粉样前体蛋白切割酶1(β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1，Bace 1)的mRNA中发现了一个miR-485-5p结合位点，lnc Bace 1反转录本通过与miR-485-5p竞争性结合Bace 1从而阻止miRNA抑制Bace 1。

4.部分miRNA由lncRNA产生:曾有研究报道,lnc MD1可分别从内含子和外显子生成miR-206和miR-133[15]。同时，lnc H19已被证实能在小鼠体内产生miR-675[16]。

二、lncRNA与miRNA间相互作用对GC的影响

lncRNA和miRNA间的相互调控参与着肿瘤性疾病的各个病理生理过程。这里，将根据现有的lncRNA的主要类型，概述lncRNA-miRNA在GC发生、发展过程中的重要作用。

1.H19：H19是最早报道的印记基因之一，最初，人们发现H19在胚胎中有较高水平的表达，其在进化过程中的高度保守性表明其一定具有重要作用。H19是一个2.3kb的lncRNA，由位于人类染色体11p15.5上的H19/Igf 2基因簇转录而成[17]。H19最初被认为具有抑制肿瘤的能力，经过一系列研究证实，H19被确认为致癌调节因子，在膀胱癌、乳腺癌和结直肠癌等各种恶性肿瘤疾病中均有明显的过表达，H19可能是肿瘤细胞或组织特异性基因，但其作为肿瘤进展的作用是抑制或促进仍有争议[18,19]。

Liu等[20]在一系列研究中发现，H19依赖于miR-675来增强GC AGS细胞的增殖和侵袭，并且miR-675的表达与GC患者中的H19呈正相关。随后，肿瘤抑制基因结构域转录因子1(RUNX1)被证实是H19/miR-675轴的下游分子，因为H19或miR-675的过表达显著降低了AGS细胞中的RUNX1表达，并且敲除了H19或miR-675后RUNX1表达量增高。更重要的是，Liu进一步证明RUNX1的引入抑制了H19/miR-675诱导的AKT/mTOR途径的激活。研究者认为，RUNX1是H19/miR-675轴与AKT/mTOR信号通路之间联系的关键分子，并且H19/miR-675诱导的GC进展中的关键介质。同样，Yan等[21]研究发现，作为miR-675的前体，H19/miR-675轴通过FADD/caspase-8/caspase-3信号通路促进了GC的发生、发展。 在GC细胞株SGC-7901和MKN 45中，Zhou等[22]研究发现，miR-141通过与H19结合而抑制其的表达，进而导致H19的降解。miR-141高表达后，包括miR-675、IGF1和IGF2在内的H19靶点均呈下降趋势。同时，H19还对miR-141的靶基因Drosha、Dicer以及zeb 1进行了调控。关于H19临床意义和作用机制多种多样，诸多研究表明H19在不同水平上可能有助于评估GC患者的死亡风险，H19有望成为GC治疗的靶点。

2.HOTAIR:HOTAIR是一种已知的含有2158个核苷酸的lncRNA，它不编码任何蛋白质，而是通过改变染色质结构在基因调控中发挥重要作用。HOTAIR被认为与多种人类肿瘤性疾病有关，它的高表达可以促进包括GC在内大多数肿瘤的侵袭和转移等病理生理过程[23]。Wang等[24]研究发现，与正常对照组比较，GC组织HOTAIR的表达量较高，miR-217表达量较低，且miR-217的低表达及HOTAIR的高表达与GCTNM分期相关。同时，miR-217的表达与HOTAIR表达呈负相关。 HOTAIR的异常表达促进了GC细胞增殖和迁移，抑制了miR-217表达并增强了GPC5和PTPN14的表达。此外，研究者还证明了HOTAIR的过表达提高了GC细胞紫杉醇和阿霉素的耐药，miR-217的过表达则相反。这些数据表明HOTAIR的过表达通过抑制miR-217表达从而增强了GC细胞中的紫杉醇和阿霉素的耐药。Cheng等[25]同样发现在GC细胞中，HOTAIR可直接与miR-34a结合并通过PI3K/AKT和Wnt/β-catenin信号通路调控GC细胞的顺铂耐药性。

3.MEG 3:lncRNA MEG 3位于人类染色体14q32.3上，是一种在许多正常组织中表达的lncRNA。然而，在许多肿瘤和肿瘤衍生细胞系中，它经常丢失、突变或降低。适当恢复MEG 3表达水平可以抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡和自噬[26]。这些发现提示MEG 3是具有抑癌活性的lncRNAs之一。Dan等[27]在GC组织和细胞系(MKN74、MKN45、SGC7901、AGS)中观察到MEG 3表达量较低。Dan通过pcDNA3.1-MEG 3转染过表达的MEG 3显著抑制了GC细胞的细胞增殖、迁移和侵袭。生物信息学预测揭示MEG 3和miR-21之间存在靶向关系。在GC组织和细胞系中观察到过表达的miR-21。荧光素酶报告测定的结果表明miR-21是MEG 3的靶基因，并且实时荧光定量PCR的结果表明miR-21的表达受MEG 3的负调节。此外，过表达的miR-21可促进细胞增殖和转移。然而，pcDNA3.1-MEG 3转染可以抵消miR-21模拟物对GC细胞增殖和转移的促进作用，表明MEG 3通过抑制miR-21表达影响GC细胞的增殖和转移。最后，小鼠肿瘤模型实验表明，过表达的MEG 3还可以通过抑制miR-21的表达来抑制体内肿瘤的生长和转移。Dan的研究揭示了MEG 3/miR-21轴在GC进展中的调节作用，并为GC治疗提供了新的潜在治疗策略。2015年，Peng等[28]经研究证实，在GC组织中MEG 3的表达水平与正常组织比较降低并与GC患者密切相关，MEG 3作为ceRNA竞争结合miR-181a调控Bcl-2的表达从而抑制GC细胞的增殖、迁移和侵袭。

4.GAPLINC:GAPLINC是一种新发现的924bp的lncRNA，通过转录起始位点数据库预测其启动子区域含有MRE。Diao等[29]在GC组织中发现GAPLINC和MAPK 1之间存在显著的正相关关系。GAPLINC依赖于MAPK 1从而对GC细胞增殖和细胞周期的促进作用。最后，Diao等[29]首次证明了GAPLINC充当miR-378分子海绵，从而促进了MAPK 1的表达。

5.NNT-AS1:lncRNA NNT-AS1在多类肿瘤中具有癌基因的作用，调控肿瘤细胞的侵袭、转移、耐药等多种病理生理过程。近来，Chen等[30]深入地研究了NNT-AS1在GC发生中的生物学作用。结果表明，与癌旁正常组织和正常细胞系比较，GC组织和细胞系中NNT-AS1的表达水平明显上调。NNT-AS1异位高表达提示GC患者预后不良。体外实验证实，NNT-AS1基因敲除抑制了GC细胞的增殖和侵袭能力，诱导GC细胞周期阻滞于G0/G1期。在体内异种移植实验中，NNT-AS1沉默抑制了GC细胞的生长。生物信息学在线程序预测miR-424的目标是NNT-AS1的3′UTR。Chen通过荧光素酶报告法、RNA免疫沉淀法(RIP)和RNA下拉法证实了NNT-AS1和miR-424之间的分子结合，从而共同形成RNA诱导的沉默复合物(RISC)。证实了E2F1是NNT-AS1/miR-424的靶基因，NNT-AS1以“海绵”的形式作用于miR-424/E2F1从而促进了GC的发生和发展进程。

6.BLACAT1:lncRNA膀胱癌相关转录物-1(bladder cancer associated transcript-1，BLACAT1)，又被称为lnc UBC 1，位于人类染色体1q32.1上，其转录本为2616kb，只有一个外显子，首次被报道为与膀胱癌淋巴结转移和预后负相关。Wu等[31]研究了BLACAT1在GC化学治疗耐药中的作用和潜在调节机制。结果显示，与奥沙利铂敏感GC组织和亲代细胞系比较，奥沙利铂抗性GC组织和细胞中BLACAT1表达上调。在体外，BLACAT1敲除降低了耐药相关基因和ABCB1蛋白的表达水平。此外，BLACAT1敲除显著促进细胞凋亡、侵袭和奥沙利铂的IC50值。在体内，敲出BLACAT1可抑制GC细胞的生长。生物信息学工具和荧光素酶测定表明，miR-361均可与BLACAT1和mRNA ABCB1的3′-UTR特异性结合，发现了BLACAT1/miR-361/ABCB1调节途径。其研究结果表明，BLACAT1可通过靶向调控miR-361促进ABCB1蛋白表达，加速了奥沙利铂对GC的耐药性，为GC的化学治疗耐药提供了新的见解。

三、展 望

综上所述，非编码RNA作为多水平调控基因表达的中心分子，可以影响细胞分裂、增殖、分化、衰老和凋亡等各个方面。非编码RNA调控异常参与多种癌症的发生、发展，通过与其他转录因子的相互作用，形成一个复杂的调控网络。随着肿瘤的发展，不同种类的非编码RNA，特别是lncRNA和miRNA之间的相互作用也逐渐显现出来。本文综述了GC中lncRNA与miRNA之间的相互调控机制，着重讨论了它们在GC发生、发展中的重要作用。上述研究表明，lncRNA可以通过多种转录后机制充当miRNA的调控者或效应者，共同调控基因表达，最终影响GC的进展。虽然现有研究对非编码RNA的探索已经取得了巨大进展，但笔者对GC中lncRNA-miRNA相互作用机制的了解还不够充分，还需要在以下几方面进行更深入的探索：(1)深度分析国内外相关数据库数据，充分利用生物信息学技术，进一步揭示lncRNA-miRNA调控网络的生物学意义。(2)加强实施大样本动物实验研究，推进lncRNA-miRNA调控网络的实际应用。(3)对lncRNA相关miRNA进行系统分析，充分阐明lncRNA-miRNA调控网络。lncRNA-miRNA调控网络的明确或许可为GC提供全新的临床诊疗策略。