金纳米颗粒修饰酶生物电极检测亚硝酸盐

李佳汶, 马伟师, 陈 佳, 李瑞桢, 袁基刚, 刘兴勇, 梅昌艮

(1.四川轻化工大学a.化学与环境工程学院；b.化学工程学院， 四川 自贡 643000；2. 国家城市污水处理及资源化工程技术研究中心川南分中心， 四川 自贡 643000)

引 言

金纳米颗粒(Au NPs)是一种具有很多优点的纳米材料，比如：能够快速、简单地化学合成；形状可控；粒径分布窄；生物相容性好和易结合等[14-16]，已在生物电极中被广泛应用。已有研究表明，Au NPs作为修饰材料不仅能提高电极的响应速度，而且由于其较高的稳定性和生物兼容性，还能够较好地保持其上固定的生物活性酶的生物活性[17-18]。

另外，酶等生物识别元件是生物电极具有特异性检测性能的关键，除识别元件的成功固定外，识别元件的固有结构及生物活性的保持也是酶生物电极制备的关键。聚多巴胺(PDA)由于可以很容易地黏附在几乎所有类型的无机及有机基质表面，还具有可控的薄膜厚度和持久的稳定性等特性，因此是一种理想的固定剂。近年来，由于其优异的生物相容性，PDA经常被用作固定酶的合适基质[19-22]。相比于其他不活泼或绝缘的聚合物粘结剂，PDA含有的邻苯二酚基团具有氧化还原活性，理论上是一种理想的能够保持电极电化学活性的粘结剂材料[23-24]。

本文制备了一种新型的金纳米颗粒修饰的酶生物电极，用于电化学定量分析检测亚硝酸盐。由于碳纸(CP)具有高比表面积和良好的电导率等优异的特性，选择使用CP作为电极基底。为进一步加速电子传递并加强酶与电极之间的导电接触，使用Au NPs修饰 CP。利用PDA的媒介作用将CcR固定在Au NPs修饰的CP上。采用物理化学表征技术对制备的酶生物电极进行了表征，结果表明酶生物电极已成功制备，通过建立亚硝酸盐浓度与电极还原峰电流密度之间的关系，实现了亚硝酸盐的定量检测。

1 实验部分

1.1 实验仪器与试剂

VEGA3SBU型扫描电子显微镜(捷克 TESCAN公司)；X Flash Detector 410-M型X射线能谱仪(德国Broker公司)；DHG-9076 A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；CHI660E型电化学工作站、铂丝对电极、CHI150 饱和甘汞电极(上海辰华仪器有限公司)；PB-10 型pH 计(德国赛多利斯有限公司)。

细胞色素C还原酶CcR(99.9%，美国SIGMA- ALORICH公司)；氯金酸HAuCl4·3H2O(>99.9%，阿达玛斯试剂有限公司)；多巴胺DA(>98%，BBI生命科学有限公司)；三(羟甲基)氨基甲烷Tris-HCl(≥99%，生工生物工程(上海)股份有限公司)；HCP010N型碳纸(21 cm×20 cm×0.1 mm，上海河森电气有限公司)；其余试剂均为分析纯，购买自国药集团化学试剂有限公司；实验所用试验用水为提取自UPC-I-10T型优普系列超纯水机的超纯水(电阻率18.25 MΩ，成都超纯科技有限公司)。

1.2 Au NPs的制备

将所有玻璃仪器在王水中彻底清洗，使用超纯水彻底冲洗后于烘箱中40 ℃烘干备用。将100 mL含0.117 g/L的HAuCl4的水溶液加热至沸腾，迅速向沸腾溶液中加入1.173 mL配置好的1%的柠檬酸钠并持续搅拌。当溶液颜色由淡黄色变为酒红色时继续计时沸腾10 min，随后停止加热，继续搅拌15 min后将制备的Au NPs胶体避光密封保存在4 ℃下备用。

1.3 CcR/PDA/Au NPs/CP 酶生物电极的制备

将CP依次浸入丙酮、乙醇、超纯水中超声清洗30 min后在80 ℃下对其进行烘干处理。为了控制CP电极的面积，CP电极在修饰前其表面均用美国3M公司4-1000型防水胶带控制，工作面积为0.1256 cm2。

将50 μL制备的Au NPs胶体滴涂在CP工作面积表面并将其在37 ℃下干燥。将干燥后的Au NPs/CP电极浸入搅拌中的20 mM多巴胺溶液(溶剂为0.05 M Tris-HCl，pH8.5)中3 h，取出电极，用超纯水冲洗电极表面以消除过量的多巴胺。将电极在4 °C下与20 μL CcR溶液(浓度为20 mg/mL，溶剂为PBS缓冲溶液，pH为7.0)共同孵育12 h制得CcR/PDA/Au NPs/CP酶生物电极。

1.4 亚硝酸盐的检测

电化学相关性能测试及亚硝酸盐检测实验采用三电极体系：饱和甘汞电极(SCE)作为参比电极，铂丝电极作为对电极，CcR/PDA/Au NPs/CP电极作为工作电极。在电化学检测之前将电极置于PBS缓冲液(pH=7.0)中多次进行循环伏安扫描以获得稳定的电信号。

2 实验结果与讨论

2.1 所制备电极的物理化学性质表征

采用扫描电子显微镜(SEM)对所制备电极的表面形貌进行表征，如图1所示。从图1a和图1b 中可以看出，CP表面由表面光滑、直径约为10 μm的碳纤维交织成网状结构，具有良好的孔隙度。

由图1c可以看出，当CP被Au NPs修饰后，CP上碳纤维表面不再光滑，出现许多纳米颗粒。由放大图(图1d)可以看出，碳纤维上纳米颗粒的分布比较均匀，无明显聚集现象。

由图1e和图1f可以看出，当通过PDA的媒介作用将CcR固定到Au NPs/CP上后，电极表面形成了一层光亮的、均匀的膜。

a-b: 碳纸电极(CP);c-d: 金纳米颗粒修饰碳纸电极(Au NPs/CP);e-f: 细胞色素C还原酶-聚多巴胺-金纳米颗粒-碳纸电极(CcR/PDA/Au NPs/CP)
图1 不同放大倍数下所制备电极表面的SEM图谱

采用X射线能谱仪(EDS)对所制备的Au NPs/CP电极的元素组成进行表征，如图2所示。从图2a中可以看出所制备的Au NPs/CP电极只含有Au和C两种元素，不含其他元素杂质，结合SEM结果说明Au纳米颗粒已经成功附着在CP电极上。

通过Au NPs/CP 电极的EDS元素面分布图(图2b和图2c)对比中可以看出 AuNPs/CP 电极的C元素和Au元素的位置基本一致，说明Au NPs沉积的位置是在CP电极的碳纤维上，同时从图2c可以看出，所沉积的Au NPs分布均匀。

a: Au NPs/CP 电极表面EDS能谱图;b-c:Au NPs/CP电极元素面分布
图2 X射线能谱仪对Au NPs/CP电极的元素组成表征

2.2 所制备电极的电化学性能表征

交流阻抗谱(EIS)测试结果可以反映出电子在不同电极上面的转移速率，进而可以得到不同电极的阻抗差异。在电解质溶液为含有10 mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6(1∶1)的0.10 mol/L KCl 溶液、频率范围为0.01 Hz～100 kHz、振幅为5 mV的条件下，通过EIS测试对所制备电极的电化学性能进行表征，如图3所示。

图3 不同电极的电化学阻抗谱图

由图3可知，与其他电极相比，未经任何修饰的裸CP 电极的EIS谱半圆区域直径最大；在经过Au NPs修饰后，Au NPs/CP 电极的EIS谱半圆区域直径显著减小，电荷转移电阻值从2000 Ω降低到约220 Ω，说明Au NPs良好的导电性促进了电子传递；相比于Au NPs/CP电极，PDA/Au NPs/CP电极的EIS谱半圆区域直径明显增大，其原因在于PDA的弱导电性在一定程度上阻碍了电子的转移，同时也说明了PDA已经成功负载于Au NPs/CP 上；当固定了CcR后，CcR/PDA/Au NPs/CP电极相较于PDA/Au NPs/CP电极，其EIS谱半圆区域直径继续增大，原因是CcR作为导电性能差的酶阻碍了电子转移，同时也说明CcR已成功固定在电极上。

通过循环伏安(CV)测试可反映各电极的电催化性能，在扫描速度为10 mV/S的情况下，所制备电极在不同溶液中的CV图如图4所示。在图4中，由曲线a可以看出，在PBS缓冲液中，裸CP无电化学响应电流；当Au NPs修饰CP以后，电化学响应电流增强(曲线b)，表明Au NPs增强了电极的导电性及电化学响应；由曲线c可知，PDA/Au NPs/CP在-0.004 V和-0.1 V位置出现了一对氧化还原峰，这是由于PDA的邻苯二酚官能团的电化学氧化还原反应[25]，进一步说明PDA成功附着在Au NPs/CP表面；由曲线d可知，CcR/PDA/Au NPs/CP在+0.05 V和-0.15 V位置出现了一对氧化还原峰，这是由于CcR中Fe(III)/ Fe(II)的氧化还原反应[26]，这进一步说明CcR已通过PDA的媒介作用成功地固定在电极表面。

2.3 CcR/PDA/Au NPs/CP电极还原峰电流与浓度之间的关系

3 结束语

采用Au NPs修饰CP电极提高了电极的导电性及电化学响应，同时其纳米尺寸增加了电极的比表面积，为后续CcR酶生物元件的固定提供了良好的平台。利用PDA良好的附着性及氧化还原活性，固定CcR，同时作为保持酶与电极之间的电化学传递的媒介。Au NPs和PDA良好的生物相容性保持了酶的催化活性，结果表明所制备的CcR/PDA/Au NPs/CP电极在亚硝酸盐的检测中取得了良好的电化学响应。本研究为使用酶生物电极构建亚硝酸盐电化学传感器提供了可行的思路与实验支持。