高温大曲中一株产香细菌的筛选及香气成分分析

周阳子， 边名鸿， 刘文艺， 蒋佳静， 许文静

(四川轻化工大学生物工程学院， 四川 自贡 643000)

引 言

酱香型白酒是中国白酒四大基本香型之一，在酱香型白酒生产中酱香物质主要来源于高温大曲，其形成与微生物的代谢活动及美拉德反应有密切联系[1]。高温大曲发酵时间长，中后期品温高达60 ℃以上，独特的制曲工艺形成了特殊的微生物区系[2]。在高温大曲中主要以细菌居多，霉菌次之，酵母菌最少，有研究说高温大曲是一种“细菌曲”[3-4]。细菌作为酱香型白酒酿造过程中最重要的一类微生物，对增强酱香型白酒风味、提高质量起着重要作用，一直以来都是研究的重点与热点。信春晖等[5]曾报道过嗜热芽孢杆菌是产生酱香风味和芝麻香风味的主要菌种。姜鹏[6]等将三株产香突出细菌优化后添加至大曲中，大曲的质量有所改善，白酒出酒率、原酒总酸和总酯均有所提高。TANG[7]等使用高通量测序研究茅台和国台大曲细菌的多样性，其细菌丰富度不同但细菌菌落组成是基本一致。对高温大曲中细菌的研究，有利于揭示酱香的形成机制。

本文从高温大曲中筛选出产香细菌，对其进行了耐受性试验，并通过固态发酵试验研究了该菌的挥发性风味产物及对酱香的贡献，为产酱香微生物的挖掘及应用提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料

高温大曲样品，取自赤水河畔的名优酒厂。大米、小麦、麸皮：均为市售。

1.1.2 培养基

营养琼脂培养基(g/100 mL)：牛肉膏0.5，蛋白胨1.0，NaCl 0.5，琼脂2.0。

细菌液体培养基(g/100 mL)：牛肉膏0.5，蛋白胨1.0，NaCl 0.5。

高粱小麦固体发酵培养基：小麦与高粱质量比为1:1，小麦全部粉碎，高粱部分粉碎；加入50%的水浸润。

1.2 产香细菌的筛选

1.2.1 产香细菌的分离

称取5g粉碎均匀的大曲，放入装有95 mL生理盐水和少数玻璃珠的250 mL锥形瓶中，置于摇床振荡30 min，得到大曲浸出液。将大曲浸出液作十倍梯度稀释，取稀释倍数为10-4、10-5、10-6、10-7的稀释液0.1 mL直接涂布于营养琼脂培养基上，分别采用常温法(37 ℃的恒温培养1～2 d)和高温法(50 ℃的恒温培养1～2 d)两种方法进行筛选，将长势良好且菌落形态有较大差异的细菌，划线纯化后在4 ℃下斜面保存备用。

1.2.2 产香细菌的复筛

取初筛菌株接种于细菌液体培养基中，37 ℃摇床培养24 h即为细菌种子液。将细菌种子液按照10%的接种量添加至高粱小麦固体发酵培养基中，按照35 ℃→40 ℃→45 ℃→50 ℃→55 ℃进行梯度升温，每培养24 h升温5 ℃，共培养5 d。对照组操作一致，但不接入细菌种子液。固态发酵完成后，将从酸味、酱味和异味等三个方面对菌株固态发酵产物进行嗅闻感官评价，筛选出整体香气协调，特征香味突出的菌株进行接下来的实验。

1.2.3 菌种的鉴定

菌株形态及生理生化鉴定：对纯化后单菌落的形态、颜色、大小进行观察。对菌种进行革兰氏反应、V.P.反应、7%NaCl 耐盐生长、厌氧生长、淀粉水解等一系列试验，并参照《伯杰细菌鉴定手册》加以对比鉴定。

16S rRNA序列同源性分析鉴定：按照细菌基因组DNA提取试剂盒操作进行基因组DNA的提取，并以27F和1492R为引物进行PCR扩增，将扩增产物送上海生工股份有限公司测序。将测序结果在NCBI中进行BLAST比对，利用MEGA6.0软件建树，并进行系统发育学分析。

1.2.4 产香细菌的生长特性研究

(1)生长曲线的测定：将分离筛选出的产香细菌接种于细菌液体培养基中，于37 ℃，160 r/min摇床培养，每隔2 h取1次样，空白对照为不接种的细菌液体培养基，于600 nm处测其OD值。

(2)耐受特性分析

以OD600为指标，在原有细菌液体培养基的基础上，分别考察温度(25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃)，pH值(1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5)，酒精浓度(v/v)(0%、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%)，NaCl浓度(m/v)(5%、8%、11%、14%、17%、20%、23%、26%)、葡萄糖浓度(m/v)(0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%)5个因素对细菌生长情况的影响，恒温摇床培养24 h测定数据。

1.2.5 产香细菌固态发酵风味成分分析

采用顶空固相微萃取-气质联用分析检测固态发酵产物挥发性风味物质。准确称取菌株固态发酵后的发酵产物样品2 g，装入5 mL顶空样品瓶中，加入50 μL浓度为20 mg/100 mL的乙酸丁酯内标。平衡条件：温度设为55 ℃，平衡时间为20 min，萃取时间为50 min。GC-MS分析条件设定按照参考文献[8]。将检测结构与数据库中质谱信息进行比对，确定挥发性风味成分，根据内标和各挥发性成分的峰面积数据，按峰面积归一化法[9]计算出样品中各挥发性风味物质的相对含量。

2 结果与讨论

2.1 产香细菌的筛选

2.1.1 产香细菌的分离纯化

通过稀释涂布分离法，采用常温法、高温法两种方法，对曲样进行平板菌落分离，从高温大曲中共分离得到23株菌落形态上有较大差异的菌株，菌落形态描述见表1。

2.1.2 产香细菌复筛

将分离纯化的23株菌株活化后，在无菌条件下接种于液体培养基中，37 ℃振荡培养1 d，再按10%的接种量将其接种于高粱小麦固体培养基中，35 ℃→55 ℃梯度升温，每培养24 h升5 ℃，共静置培养5 d，根据感官评定，从中筛选出酱香风味浓郁的菌株进行GC-MS分析，固态发酵产物感官评定见表2。

表1 不同细菌菌落形态描述

由表2可以看出，不同的细菌在相同条件下固态发酵后呈现不同的感官。未接入细菌的对照组没有一点酱味，只有一点点酸味和异味，由于小麦和高粱在蒸煮后又经过高温烘焙，本身存在一定的香气，但并未产生酱香味。大多数细菌高温固态发酵后产生酱味，但有些细菌不仅没有酱味，还产生了强烈的异味，如XJ-8、XJ-17。XJ-12、XJ-15、XJ-16产酱香味大也有较大的酸味，没有异味， 这可能是由于高温大曲中的细菌在发酵过程中会产生一定的酸，同时酸也是酱香型白酒的一大特征。经感官初步评定，筛选酱味较强，异味较小的XJ-12进一步试验。

2.1.3 细菌XJ-12的鉴定

对XJ-12进行形态学观察、生理生化、分子鉴定，由图1可知，菌落成不规则圆形，颜色为白色，边缘不整齐，表面湿润，镜检形态为革兰氏阳性菌。生理生化试验结果见表3，菌株在55 ℃下能生长，7%NaCl环境中能生长，兼性厌氧，试验结果与《伯杰细菌鉴定手册》中地衣芽孢杆菌的生理生化特性基本一致[10]。

表2 产香细菌固态发酵的感官评定

注：表中数字代表气味强度，从0到10逐渐增强，0为最弱，10为最强。

图1 细菌菌落形态和显微形态图

表3 细菌生理生化实验

注: + : 阳性反应; - : 阴性反应。

由图2可知，XJ-12和地衣芽孢杆菌聚为一类，结合菌株形态、生理生化试验，初步鉴定XJ-12菌株为地衣芽孢杆菌，登录号为MK859992。在高温大曲的制作过程中，由于温度的升高，氧气含量相对减少，地衣芽孢杆菌等耐高温、兼性厌氧的芽孢杆菌成为了高温大曲中的优势菌群[11]。

图2 细菌的系统发育树

2.2 产香细菌的生长特性研究

(1)菌株生长曲线的测定

由图3可知，该细菌生长较为迅速，培养4 h后逐渐进入对数期，18 h时OD600达到最大，此后菌株生长较为平缓，进入稳定期。

图3 细菌的生长曲线

(2)耐受特性分析

①耐温性试验

高温制曲发酵过程中，网罗富集了优势微生物，同时形成相应的香味物质[14]，研究菌株对温度的耐受性，有助于筛选嗜温微生物并合理有效地将其应用到酿酒生产实践中。由图4可知，菌株能在30 ℃～40 ℃之间能较好地生长，且在55 ℃左右也能生长，耐温性较好。

图4 不同温度对细菌生长的影响

②耐酸试验

由于发酵环境为酸性环境，发酵产酸快，pH较低，因此对酿酒微生物耐酸性要求较高，同时pH能改变微生物细胞中的电解质，从而对微生物的生长代谢造成一定影响[15]。由图5可知，菌株在pH值大于4时均能较好生长。当pH值小于3.5，其生长量明显降低。

图5 不同pH值对细菌生长的影响

③耐酒精试验

酒精对细胞的抑制作用比较复杂，重点体现在它能够抑制细菌的存活和增殖[16]。图6可知，初始乙醇浓度越高，OD值越小，当乙醇浓度在10%以上时，该菌的生长受到明显抑制，对菌株生长的影响差异不显著(P>0.05)，几乎不生长，该菌的最大耐酒精浓度为8%。

图6 不同酒精浓度对细菌生长的影响

④耐盐试验

由图7可知，该菌株耐盐能力较好，能在14%的NaCl浓度中生长，在8%的NaCl浓度中OD值达到最大，菌株此时生长情况最好；在当盐浓度高于17%时，对菌株生长的影响差异不显著(P>0.05)，菌株生长受到抑制[17]。

图7 不同NaCl浓度对细菌生长的影响

⑤耐糖度试验

由图8可知，初始糖浓度越高，OD值越小。当初始糖浓度达到 30%时，该菌几乎不生长，对菌株生长的影响差异不显著(P>0.05)。高浓度的糖通过影响细胞的渗透性对细菌生长繁殖产生抑制，该菌的最高耐糖度为25%，具有较好的耐受性。

图8 不同糖度对细菌的影响

2.3 产香细菌固态发酵风味成分分析

将XJ-12进行固态发酵后，采用顶空固相微萃取法检测固态发酵产物挥发性风味物质的含量，结果见表4。XJ-12固态发酵产物挥发性成分共有39种，主要有2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、苯酚、苯乙醇、辛酸乙酯、乙偶姻、愈创木酚、正己酸乙酯，这些挥发性成分是组成酱香风味的重要物质。而有些成分则是固态发酵后特有的，如2,4,5,6-四氨基嘧啶33、2-癸酮、2-甲基丁酸-2-苯乙酯、异丁酸乙酯、异戊醇等，在已有的研究中，这些成分在酱香型白酒中均有检测到[18]。

表4 XJ-12固态发酵产物挥发性风味成分

由表4可知，XJ-12菌株固态发酵产物挥发性成分中2,3,5,6-四甲基吡嗪含量最高，占总含量的15.96%，苯酚、苯乙醇等芳香族化合物含量较多，同时还有较高的乙偶姻和异戊酸、正丁醇。丁酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸异丁酯等酯类化合物，占总含量的23.95%。在已有的高温大曲产香细菌的研究中，其代谢产物以四甲基吡嗪为主要特性化合物，同时具有较高的乙偶姻，本研究中产香细菌XJ-12产吡嗪能力较强，这与相关研究相符合[19]。除此以外，XJ-12产生的酯类化合物也较为丰富，在白酒风味形成中，这些酯类物质也起着关键性作用。

3 结束语

本研究通过稀释涂布分离法，采用常温法、高温法两种方法从高温大曲中共分离得到23株菌落形态上有较大差异的菌株。通过感官嗅闻法，筛选得到XJ-12酱香最为突出，经过形态学观察、生理生化、分子鉴定初步鉴定该菌株为地衣芽孢杆菌。研究了该菌的生长耐受性，发现该菌生长较为迅速，对温度、盐及糖度都有较好的耐受性。通过固态发酵发现地衣芽孢杆菌挥发性产物主要有2,3,5,6-四甲基吡嗪、乙偶姻、苯乙醇、苯酚、苯乙酸乙酯等，其中2,3,5,6-四甲基吡嗪含量最高，占总含量的15.96%，同时酯类物质含量也较为丰富。该地衣芽孢杆菌具有很好的耐受能力与产酱香能力，具有较好的开发潜力和应用价值。