高效液相色谱法测定养阴镇静片中丹参素的含量

薛雅光，薛雅峰，郝羚竹，闫小钧，赵琳琳，郭美玲

（1.吉林省药品检验所，吉林 长春 130033；2.吉林省医疗器械检验所，吉林 长春 130062）

0 引言

方中以丹参养血活血，清热除烦为佐药。丹参作为唇形科植物，根茎比较发达，早在《神农本草经》中就有记载，根茎干燥、粗壮被列为上品药材[1-2]。丹参中的有效成分为脂溶性及水溶性两大类，水溶性成分具有抑制血小板聚集、保护心肌、防治动脉粥样硬化、抗肝损伤抗肌纤维化、诱导细胞凋亡等作用[3]。研究发现，丹参中的水溶性成分为酚酸类，主要有丹参素（danshensu）、原儿茶醛（protocatechuic aldehyde）、丹酚酸B（salvianolic acid B）、迷迭香酸（rosmarinic acid）、紫草酸（lithospermic acid）、丹酚酸D（salvianolic acid D）、丹酚酸A（salvianolic acid A）和丹酚酸E（salvianolic acid E）等[4-5]。为了能够得到更为合理，健康的药品，在药品测定过程中，主要以丹参素的含量测定方法作为药品质量测定的重要依据。

1 材料与方法

1.1 材料

（1）试药。生产批号为110855-200508的丹参钠对照品作为丹参素的主要测量依据，是由中国药品生物制品检验所提供，在要求测定过程中，其作为丹参素测定的主要依据，还需要乙腈为色谱纯，水为纯化水作为主要试剂，而其余试剂则作为分析纯进行使用[6-7]。样品由长春人民制药有限公司等企业提供。

（2）主要仪器。Agilent 1200高效液相色谱仪。

1.2 方法

（1）色谱条件。色谱柱：Agilent HC C18(250×4.6 mm,5 μm)；甲醇－二甲基甲酰胺—冰醋酸—水（1∶2∶1∶96）为流动相；检测波长为283 nm；进样量 10 µL。

（2）对照品溶液。药品的测定还需要使用一定量的丹参素钠作为测定的对照品，对照品需要精密称定，然后，将50%的甲醇调制成每1 mL含50μg的溶液，也就是指每1 mL溶液中，含丹参素45μg。

（3）供试品溶液。供试品溶液的测定，需取20片丹参，人工去除包衣，采用精密称定，然后加工研细，采用精密称定，取本品约2 g，放于塞锥形瓶中，然后滴入约50 mL的盐酸溶液，约50滴，用木塞密封，进行重量的测定，然后利用超声处理（超声处理要求，30分钟，功率250瓦，频率为50千赫兹的超声仪器），然后放冷，在进行精密称定确保实验的精确性。对于盐酸溶液可能出现的不足，在进行补充，摇匀，在加入氯化钠5 g，进行摇匀、过滤。利用精密仪器量取过滤液25 mL，然后放入分液漏斗。为了得到更为真实的试品溶液，还需要分四次操作，得到乙酸乙酯液，其提取该液体的方法是分4次，向上述溶液中滴入乙酸乙酯进行摇匀，其目的是为了得到乙酸乙酯液，然后对其进行处理至干，再次对其残渣进行处理，处理残渣的方法是利用50%的甲醇进行溶解，然后放入量瓶中，稀释、摇匀和过滤，从而得到滤液，即得。

（4）阴性样品溶液。依据相关药品质量标准，配制丹参阴性对照溶液，其中的比例和制作方法都是严格按照相关标准进行，同时也参考了供试品溶液的制备方法进行阴性样品溶液的制备。

（5）干扰试验。分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液10 µL。然后依据上述色谱条件进行测定，其如图1-3所示。其结果显示，溶液中的其他成分并未对测定结果产生干扰。

图1 溶剂HPLC色谱图

图4 供试品HPLC色谱图

（6）标准曲线的绘制。分别精密吸取丹参素钠对照品溶液（浓度为97 μg/mL批号：110855-200508）1、5、10、15、20、30注入液相色谱仪，通过色谱测定条件，建立坐标系，以对照品的进样量作为横坐标，单位为μg；以色谱峰面积作为纵坐标，然后绘制出标准曲线。其计算方法为：Y=—0.447+810.16X，R2=0.999997，结果表明，丹参素钠在0.097-2.910 μg线性关系良好，符合外标法定量测定的要求。

（7）精密度试验。仪器精密度的测试方法，取长春人民制药有限公司批号20100201的同一份供试品溶液依据文章中拟定的色谱条件，对其进行6次连续精密测定，得到丹参素钠的平均峰面积为138.03，RSD为0.9%（n=6），从而证明仪器精密度非常好。

（8）稳定性试验。同样取上述供试品溶液依次进行测定0，4，8，20，24 h测定峰面积值。丹参素钠平均峰面积为292.52，RSD为1.7%（n=5），从而证明供试品溶液的性质稳定，24小时保持稳定。

（9）重现性试验。在重现性试验中，取上述供试品溶液，按正文拟订的色谱测定方法，对其分成6分，进行平行测定，其测定结果显示丹参素钠含量平均保持了217 µg/片，RSD为2.4%(n=6），从而证实了，本测定方法的重现性非常好。

（10）回收率试验。精密量取丹参素钠对照品溶液（0.7126 mg/mL）1 mL，置具塞锥形瓶中，挥干，精密加入同法测定已知含量（217 µg/片）的供试品（长春人民制药有限公司批号：20100201）1.0g，共六份，按拟订标准的方法精密加入盐酸溶液(1→50)50 mL，探后通过提取、测定，从而计算出回收率，其结果为平均回收率为99.6%，RSD为1.5%（n=6）。通过数据分析知，其测定完全符合定量分析的要求，如表1所示。

2 讨论

在本论文的书写过程中，还借鉴了Alltima C18色谱柱（250×4.6 mm,5 µm）、Diamonsil C18 色谱柱（250×4.6 mm,5 µm）和Agilent HCC18色谱柱（4.6×250 mm,5μm），三种色谱柱均达到方法系统适用性的要求。表明本实验耐用性好。

表1 回收率试验结果