采用四氯化碳诱导家兔肝纤维化模型的建立研究

刘闪闪，徐丽红，李琼，张俐娜，刘帆，杨欣，李军

肝纤维化是各种慢性肝病发展为肝硬化的必经阶段，有研究表明，肝纤维化向肝硬化的发展是渐进、可逆的过程，因此逆转肝纤维化、防止其进一步发展已经成为慢性肝病防治中的关键问题［1-2］。建立肝纤维化动物模型对肝纤维化的诊断研究及防治有重要意义，也是临床人体研究的前提［3-4］。家兔饲养简单、肝脏大小适中，是常用的肝纤维化动物模型，四氯化碳（CCl4）诱导法是国内应用最多的肝纤维化建模方法［5］。本研究对家兔皮下注射纯CCl4，旨在建立一种稳定的、死亡率较低的家兔肝纤维化模型，为临床抗炎、抗纤维化研究提供依据。

1 动物与方法

1.1 实验动物 2015年4—9月，选用健康新西兰大白兔46只，不限雌雄，体质量2.0～3.5 kg，4～6月龄，由石河子大学医学院实验动物中心提供。家兔均饲养在层叠式不锈钢丝笼中，喂食2次/d，100 g/次，自由饮用自来水。动物房通风良好，排气扇24 h开放，并使用循环风紫外线消毒机消毒至少2次/d。46只家兔分笼适应性饲养1周，编号为01～46，根据其体质量是否≥3.0 kg将家兔分为A组、B组，再使用抽签法分别将上述两组随机分为4组（A0～A3，B0～B3），A0和B0组合为G0组，余类推。其中，G0组为对照（10只），G1～G3组进行造模（各12只）。实验过程中对家兔的处置符合动物伦理学标准，并通过石河子大学医学院第一附属医院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 实验试剂 分析纯CCl4（含量≥99.5%）购于天津永晟精细化工有限公司；10%中性甲醛组织固定剂购于中山市康乃欣生物医疗科技有限公司；分析纯水合氯醛（含量≥99.5%）购于天津市福晨化学试剂厂。

1.2.2 模型制作 G0组皮下注射0.9%氯化钠溶液0.5 ml/kg，G1～G3组分别以 0.2、0.3、0.5 ml/kg的分析纯CCl4背部皮下注射，2次/周，共16周，每周称重1次。G2组起始剂量为0.3 ml/kg，3周后增加剂量为0.4 ml/kg，5周后增加剂量为0.5 ml/kg，此后维持剂量在0.5 ml/kg。造模后第4、6、8、10、12、14周，分别从G1～G3组随机选取1只家兔，8%水合氯醛盐溶液2 ml/kg耳缘静脉缓慢注射，根据实际麻醉情况自行调整麻醉剂量。麻醉成功后，立即处死家兔并取3.0 cm×1.0 cm×0.3 cm的肝组织标本。

第16周处死所有G1～G3组家兔及2只G0组家兔，造模期间死亡的家兔立即取肝组织标本进行病理学检查。

1.2.3 病理学检查 肝组织标本于10%中性甲醛溶液中固定48 h后，取10 mm×10 mm×15 mm肝脏标本置于脱水盒中，放入脱水机自动脱水、透明、浸蜡、包埋，连续切片5张，厚度为3～5 μm。分别进行HE及Masson染色，染色后的切片由病理科医师独立、盲法阅片。采用Metavir分期法，根据肝脏炎性坏死程度及肝包膜、汇管区、肝窦壁及中央静脉等处的胶原纤维增生情况对肝脏标本进行肝纤维化分期，F0期：无纤维化；F1期：汇管区纤维化扩大，局限窦周及小叶内纤维化；F2期：汇管区周围纤维化，纤维化形成，小叶结构保留；F3期：纤维间隔板小叶结构紊乱，无肝硬化；F4期：早期肝硬化［6］。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。家兔死亡率及肝纤维化造模成功率的比较采用Fisher12 3s确切概率法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 造模期间家兔一般情况 造模期间，G0组家兔均表现活泼，毛发有光泽，进食正常，大小便正常，体质量逐渐增加。G1～G3组家兔活动度欠佳，常静卧于笼中，精神萎靡，反应迟钝，肌肉松弛，肌张力差。毛发日渐蓬松、脱落、稀疏，进食减少，大小便次数及量减少，体质量日趋下降（见图1）。另外，G1～G3组家兔免疫力下降，注射部位皮肤经久不愈，甚至糜烂，其中2只家兔出现结膜炎、耳部感染。

2.2 造模3周内家兔死亡情况 各组造模3周内家兔死亡率比较，差异有统计学意义（检验统计量值=7.004，P=0.048）；其中，G3组家兔死亡率均高于G0、G1、G2组，差异有统计学意义（P＜0.001，见表1）。造模3周内死亡的7只家兔，均发生在该次造模后24～48 h，造模4周后无家兔死亡。

2.3 病理学检查 造模期间死亡的家兔肝组织表面光滑，质地较软，病理显示不同程度肝细胞肿胀、坏死，未见肝纤维化形成。G1～G3组造模第4、6、8、10、12、14周处死的家兔，肝纤维化分期见表2。第16周时处死G1～G3组家兔及2只G0组家兔，肝纤维化分期见表3。第16周时，成功建立各分期的家兔肝纤维化模型（见表4）。G1～G3组造模成功率比较，差异无统计学意义（检验统计量值=4.747，P=0.165）。家兔肝纤维化各分期病理学检查结果见图2、3。

3 讨论

肝纤维化动物模型的建立有多种方法［3］，需同时兼顾造模的重复性、可预测性、可比性和经济性等多因素，CCl4造模法最常使用［5］。

不同的给药途径可产生不同的造模效果，CCl4造模法常见的给药途径有口服、腹腔注射、皮下注射等，有学者采用皮下注射法成功建立了大鼠肝纤维化模型［7-8］。周贤等［8］研究显示，CCl4皮下注射法建立动物肝纤维化模型死亡率低，成模时间短。刘满荣等［9］通过不同给药途径建立家兔肝纤维化模型的对比研究认为，腹腔注射吸收快，肝毒性大，易导致急性肝衰竭；喂养法CCl4服入剂量受动物食欲影响较大，有效剂量难以控制，导致CCl4的刺激性和肝毒性较小，造模周期长；皮下注射给药时吸收较缓慢，较符合肝纤维化形成的缓慢过程，是最佳的给药途径。

图1 造模期间G0～G3组家兔体质量变化Figure 1 Weight changes of rabbits in groups G0，G1，G2 and G3 during modeling

表1 各组家兔造模3周内（前6次造模）死亡情况（只）Table 1 Death number in the four groups within three weeks of modeling by the first six interventions

表2 造模8～14周处死家兔肝纤维化分期（期）Table 2 Staging of liver fibrosis of rabbits in groups G1，G2 and G3 sacrificed between the 8th and 14th weeks of modeling

表3 造模16周时G0～G3组家兔肝纤维化分期（只）Table 3 Staging of liver fibrosis of rabbits in the four groups at the end of the 16th week of modeling

图2 家兔肝纤维化各分期病理学检查结果（HE染色，×40）Figure 2 Pathological fibrosis staging in rabbits12 3 liver tissue

图3 家兔肝纤维化各分期病理学检查结果（Masson染色，×40）Figure 3 Pathological fibrosis staging in rabbits12 3 liver tissue

表4 G1～G3组家兔肝纤维化造模成功只数（只）Table 4 The number of successfully establishing rabbit models of liver fibrosis in groups G1，G2 and G3

肝脏细胞具有较强的再生修复机制，为维持有效的肝损伤效果，恰当的给药时间间隔十分重要。研究显示，48 h内重复给药容易导致动物急性中毒死亡，而给药超过4～5 d，肝细胞可迅速恢复，因此最有效的时间间隔为 3 d［10］。

研究显示，造模周期取决于给药剂量和给药途径，一般周期为8～16周［11］。CHANG等［12］研究表明，增加CCl4剂量可缩短造模周期，但也会增加死亡率。

家兔肝脏体积适中，血容量大，更适用于病理学和影像学观察研究，因此本研究选用家兔作为模型动物。而造模过程中给药剂量国内研究尚未统一［13-14］，结合上述文献，本研究设定G1～G3组，分别以0.2、0.3、0.5 ml/kg剂量的分析纯CCl4背部皮下注射，2次/d。参考陈宝祥等［14］研究，G2组起始剂量设为0.3 ml/kg，3周后增加剂量为0.4 ml/kg，5周后增加剂量为0.5 ml/kg，此后维持剂量在0.5 ml/kg。

本研究发现，造模期间家兔死亡多发生在3周内，4周后趋于稳定，主要原因是初期家兔因CCl4肝毒性剧烈而迅速，难以及时代谢，导致急性肝衰竭而死亡。死亡多发生在该次造模后的24～48 h，这与药物代谢动力学有关，药物在肝脏的浓度于24～48 h到达峰值，之后便逐渐减小。本研究G3组死亡率（5/12）高于其他各组，与丁可等［13］研究不同，该研究中0.5 ml/kg组前3周死亡率仅为20%，考虑与家兔品种、环境气候以及样本量小有关，有待进一步研究。陈宝祥等［14］研究显示，剂量递增法建立家兔肝纤维化模型的死亡率仅为7.1%，本研究G2组死亡率（1/12）与之相近。剂量递增法可诱导家兔耐受，不至于因高剂量、高浓度的CCl4加大肝脏负担、难以快速代谢，最终因急性肝衰竭而死亡。同时也观察到，在造模后24～48 h，家兔进食、排便活动明显减弱，48 h后逐渐恢复。因此，可根据家兔造模过程中的进食、排便情况来判断其对CCl4的耐受和代谢情况，进而实时调整给药方案。此外，CCl4具有强毒性，严重破坏机体机能、削弱自我修复能力，因此注射部位常出现糜烂、溃疡，经久不愈。G1～G3组家兔免疫力也明显下降，易罹患其他疾病，如眼结膜炎、腹泻、便秘等。

本研究造模第4周开始每2周处死1只G1～G3组家兔以了解造模进展，第14周时G2组和G3组均形成F4期模型，故决定于第16周处死所有G1～G3组家兔观察造模成功率。G1组起始剂量小、3周内死亡率低，但造模周期长，至第16周时仅有2只家兔形成F4期模型。G3组起始剂量高，虽然14周时即形成F4期模型，但短期内死亡率高，至第16周时仅存活1只家兔。G2组采用剂量递增法，低剂量诱导机体耐受，降低了早期死亡率，在14周时即形成F4期模型。

综上所述，采用CCl4皮下注射，起始剂量为0.3 ml/kg并剂量递增，可成功建立死亡率低的家兔肝纤维化模型，该造模方法值得在科研实验中推广使用。

志谢：特别感谢石河子大学医学院第一附属医院病理科及石河子大学医学院统计教研室李述刚对本研究的帮助。

作者贡献：李军进行文章的构思与设计，负责文章的质量控制及审校；徐丽红、李军进行研究的实施与可行性分析；刘闪闪、李琼、张俐娜、刘帆、杨欣进行数据收集、整理；刘闪闪进行统计学处理，并撰写论文；刘闪闪、李琼进行结果的分析与解释；刘闪闪、李军进行论文的修订，对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。