不同代次大鼠骨髓间充质干细胞Wnt/β-catenin信号通路表达分析

随着组织工程学的不断发展,干细胞已受到越来越多的关注,骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs),被证实具有多重分化潜能和广泛的免疫调节作用,可对多种免疫细胞的增殖、凋亡、免疫功能进行调节,甚至对免疫细胞的迁移能力也有一定影响[1-3]。然而,近年来一些研究发现,MSCs在某些疾病的治疗中会加剧组织纤维化的发生,严重影响治疗效果。而MSCs在体外培养扩增从P1代即开始老化,种子细胞的优化与否直接影响细胞治疗的质量及安全[4]。近期研究发现,Wnt/β-catenin信号通路参与了纤维化的发生发展,提示Wnt/β-catenin信号通路的活化在干细胞纤维化转化发生发展过程中起到重要作用[5-6]。本研究探讨不同代次MSCs的生长增殖、Wnt/β-catenin信号通路的活化情况及其成纤维分化倾向,为MSCs成为再生医学理想的种子细胞及临床应用提供更加充实的依据。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物:无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级雄性SD大鼠,体质量60～70 g,购于北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证号:SCXK(京)2016-0011。主要试剂:Dulbecco’s Modified eagle’s Medium (DMEM)低糖培养基、DAPI (4′,6-二脒基-2-苯基吲哚)、羊抗小鼠IgG-Cy3二抗(Sigma-Aldrich Inc.,美国);胎牛血清,新生牛血清(Gibco,新西兰); RNA提取试剂盒(北京天恩泽基因科技有限公司);聚合酶链式反应(PCR)引物(南京金斯瑞生物科技有限公司);PCR试剂盒(TransGen Biotech);Cell count kit 8(CCK-8,株式会社日本同仁化学研究所中国代表处);胰蛋白酶(0.25%),HEPES (C8H17N2O4SNa, 15 mmol/L),青霉素,链霉素，牛血清白蛋白(Sigma Chemical Co.,美国)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠MSCs的原代培养:二氧化碳窒息处死大鼠,无菌条件下分离股骨和胫骨,磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗骨髓腔,获得细胞悬液,经100目筛网过滤,收集细胞悬液,以1500 r/min,离心5 min,弃上清。用1∶4的PBS和ACK红细胞裂解液破红细胞,以1500 r/min,离心15 min,收集细胞。以1×106个/mL的密度接种于6孔板,采用含10%胎牛血清的DMEM基础培养基,置于37 ℃、5%CO2饱和湿度恒温培养48 h后首次换液,去除未贴壁细胞,之后每3 d换液,待细胞生长至80%融合,消化细胞,传代。

1.2.2 原代培养大鼠MSCs的鉴定:选用第3代MSCs,待细胞长至80%融合,胰酶消化后收集细胞,采用流式细胞技术检测细胞表面分子CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD79、CD90和CD133的表达。1×105个MSCs细胞一抗孵育37 ℃,2 h。PBS清洗3次,荧光素标记的二抗37 ℃,避光孵育1 h,PBS清洗3次,FACSCalibur上机检测,数据通过Paint-A-Gate 和FloJo software软件分析。

1.2.3 不同代次MSCs的增殖能力检测:将MSCs以1×106个/mL, 100μL/孔接种于96孔板内,每个检测点接种6个平行孔,分别于1～10代体外培养细胞传代后第2天,每孔加入5 mg/mL MTT 25μL, 37 ℃孵育4 h后加入150μL DMSO后继续孵育 30 min,置于酶标仪570 nm检测吸光值(OD)。以培养代次(1～10)为横坐标,OD值为纵坐标,绘制生长曲线。

1.2.4 Wnt通路相关蛋白的表达情况:采用蛋白质印迹法(Western Blot)检测不同代次MSCs中Wnt 通路相关蛋白,包括β-catenin、GSK-3β、CD14、pERK、pJNK。MSCs接种于T25培养皿,待细胞长至80%融合时弃上清,4 ℃ PBS洗3次,每瓶加入800μL RIPA裂解液,冰浴30 min。12 000 r/min 离心5 min,收集上清。采用Bradford法测定蛋白浓度,并调节各样品至等浓度。按凝胶加样缓冲液∶样品=1∶4的比例加入5×凝胶加样缓冲液。95 ℃水浴30 min。10%分离胶,加样25μL, 80 V稳压电泳。收集分离胶,电压20 V 半干转膜法转至PVDF膜。取出膜,放于封闭液(含5% 脱脂奶粉和0.3% BSA)中,4 ℃封闭过夜。一抗包被:37 ℃孵育2 h, PBST洗6次, 5 min/次。二抗包被:将膜分别浸入1∶10 000的带HRP二抗。室温孵育1 h后PBST漂洗6次。HRP-ECL化学发光法,获得蛋白印迹图片,进行图像分析。一抗为兔抗,二抗为山羊抗兔,采用β-actin作为内参。

1.2.5 不同代次MSCs中成纤维细胞分子标记表达:采用Realtime-PCR法检测不同代次MSCs中成纤维细胞分子标记Wimentin、TCF、α-SMA的表达。按试剂盒说明书提取MSCs细胞RNA,检测RNA的含量和纯度(OD 260/280),-70 ℃保存待用。PCR过程:采用软件Primer Express设计引物(表1),探针5′端标记FAM,3′端标记。采用一步法分别扩增各目的片段。10μL PCR反应体系,反应条件:56 ℃ 10 min,95 ℃变性2 min,95 ℃ 15 s,62 ℃ 45 s,42个循环,28 ℃ 5 min。在62 ℃退火阶段检测荧光信号,FAM通道检测荧光,CT值≤38判定为阳性。

1.3 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件处理,计量资料以均数±标准差表示,组内比较采用配对样本t检验,组间计量资料均数比较用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠MSCs的分离、培养与鉴定 第1代MSCs体外培养7 d后,相差显微镜观察发现,细胞贴壁,呈卵圆型或长梭形,出现旋涡状集落式生长。培养约14 d后,MSCs可达到80%融合,经过3～4次传代,MSCs增殖速度明显加快,细胞传代后3～4 d即可达到80%融合,且形态较均一;培养第9代时细胞增殖加快,形态不一(图1)。体外培养的P3代MSCs增殖速度快,形态均一,故选择P3代细胞进行流式细胞术鉴定细胞表面分子标记。结果显示,MSCs表达CD44、CD73、CD90、CD29, 不表达CD79、CD34、CD45、CD133。

表1 PCR引物表

A:原代培养MSCs 14 d;B:P3代大鼠MSCs;C:P5代大鼠MSCs;D:P7代大鼠MSCs;E: P9代大鼠MSCs图1 原代及传代培养大鼠骨髓MSCs (×100相差显微镜)

2.2 不同代次MSCs的增殖情况 MTT检测结果显示,体外培养MSCs,第1代、第2代增殖能力较弱,第3代后的增殖能力显著增强,见图2。

图2 MTT检测GFP 转染MSCs增殖活力图

2.3 Wnt通路相关蛋白的表达情况 经图像分析,与P0代MSCs相比,P3～P7代MSCs中,5种被检Wnt 通路相关蛋白表达均无显著差异;而P9代MSCs中,5种被检Wnt 通路相关蛋白表达均显著上调,见图3。

2.4 不同代次MSCs中成纤维细胞分子标记表达 与P0代MSCs相比,P3、P5代MSCs中,几种被检测的成纤维细胞分子标记的mRNA表达变化均无显著差异;P7代MSCs中,成纤维细胞分子标记Wimentin的mRNA表达显著上调,P9代MSCs中,Wimentin、TCF、α-SMA的mRNA表达均显著上调,见图4。

注:与P0代比较,*P<0.05图3 Western Blot检测不同代次MSCs Wnt信号通路蛋白表达情况

注:与P0代比较,*P<0.05图4 Realtime-PCR法检测纤维细胞分子标记表达的情况

3 讨论

MSCs因其取材方便,自我复制能力强,在体外具有很强的增殖能力,同时具有良好的可塑性等特性,已成为组织工程学研究和临床应用干细胞治疗首选[7],为医学界攻克这些人类疑难病症带来了希望[8]。但有研究发现,体外培养MSCs有时不仅会因衰老使细胞增殖能力显著降低或增生分化功能减低,还可能出现纤维化分化倾向,使骨髓来源的间充质干细胞受到限制。为了使MSCs 更好、更持久地应用于临床修复组织细胞和器官,在移植前评估细胞的生物活性显得尤为重要。

本研究取大鼠骨髓,原代分离培养MSCs,分离效率高,细胞形态良好,细胞表面标记符合干细胞特性,细胞传代稳定。随着体外培养代次的增加,MSCs的细胞形态由排列整齐的长梭形、旋涡状生长,逐渐变为网状的短梭形,细胞体积变大,旋涡状消失,排列杂乱,易于消化。观察 P1～P10 代次细胞的增殖情况,结果显示 P3 代之后细胞的增殖能力明显高于 P1、P2 代,本研究中的细胞形态观察结果与生长曲线试验结果高度吻合,与Wagner等[9]的研究结果一致。MSCs的衰老,可导致其分化能力减低,随着体外培养代次的增加,细胞的生物学特性会发生一系列改变,细胞的分化倾向有明显改变。Polo等[10]认为干细胞连续传代会逐渐改变供体细胞表观遗传学信息,进而可能影响其分化倾向,但其具体分子机制尚不明确。MSCs衰老还可能导致其分化能力受损,Kim等[11]发现不同代次的MSCs成骨分化能力不同,6代以后明显减弱,该研究认为作为组织工程种子细胞不宜超过5代。

近期研究发现,Wnt/β-catenin信号通路参与了多种组织纤维化的发生与发展[12-13]。提示Wnt/β-catenin信号通路的活化在干细胞成纤维化分化的过程中可能有重要作用。本实验的研究结果发现,随细胞培养代次的增加,细胞内Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达逐步增强,在P9代细胞中出现明显的Wnt/β-catenin信号通路活化。而Wnt/β-catenin信号通路活化与多个器官纤维化的发生与发展密切相关。本研究在MSCs体外培养P9代细胞中也检测到了成纤维细胞表面标记,证实MSCs体外培养P9代已出现成纤维分化倾向。

总而言之,不同代次的MSCs具有不同的分化异质性。本研究结果显示作为种子细胞不宜超过P9代, P3～P7代具有纯度高、倍增快等优点,是能够满足组织工程细胞植入的种子细胞。从干细胞治疗的质控要求考虑,宜选择P3～P7代次MSCs为佳。