蒲参胶囊对大鼠脑缺血/再灌注后GAP-43和β-TubulinⅢ蛋白表达的影响

朱 清 姚蓓蓓 吴明华

（南京中医药大学附属医院，南京中医药大学第一临床医学院，江苏 南京 210029）

脑缺血性脑血管病是严重威胁人类健康的常见病及多发病，伴随着脑组织快速的缺血缺氧，大量的神经元坏死，导致神经系统不可逆的损伤，而神经再生是脑缺血后神经功能恢复的关键。生长相关蛋白43（GAP-43）主要表达于发育或再生轴突的生长锥末端，与神经发育、轴突再生、突触重建密切相关，是神经突起生长与再生的标记。β微管蛋白Ⅲ（β-TubulinⅢ）是神经细胞的特异性微管蛋白，也是细胞骨架家族成员之一，被认为是神经元发育的标志［1］。因此这两种蛋白均可反映脑缺血后内源性神经再生情况。

蒲参胶囊是由第四军医大学药物研究所研制的复方中成药，由何首乌、蒲黄、丹参、川芎、赤芍、山楂、泽泻、党参8味药物组成。本实验通过观察蒲参胶囊对大鼠脑缺血/再灌注后梗死区周边组织GAP-43及β-TubulinⅢ蛋白表达的影响，探究蒲参胶囊对脑缺血后神经再生修复的作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 Sprague-Dawley（SD）大鼠，96只，雄性，体质量250～280 g，SPF级，来源：北京维通利华实验动物有限公司。许可证号：SCXK（京）2012-0001。动物合格证号：11400700173737。

1.2 试药与仪器 1）药物与试剂。蒲参胶囊粉剂（由苏中药业提供，药物组成：何首乌、蒲黄、丹参、川芎、赤芍、山楂、泽泻、党参），实验前用0.9%氯化钠注射液溶解。鼠抗β3-Tubulin、兔抗GAP43：美国CST公司。鼠抗β-actin：美国ImmunoWay公司。羊抗兔二抗：Biosharp公司。羊抗鼠二抗：美国Abcam公司。2）仪器。球磨仪：德国Retsch公司。高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司。多功能酶标仪：TECAN公司。电泳槽、半干转膜仪、蛋白印迹-多功能成像系统：美国Bio-Rad公司。转移摇床：海门市其林贝尔仪器有限公司。

1.3 分组与造模 将96只大鼠随机分为5组，即假手术组、模型组、高剂量组（250 mg/200 g）、中剂量组（125 mg/200 g）、低剂量组（62.5 mg/200 g）。 造模成功后，所有大鼠均接受每日1次灌胃给药。其中分别于7 d、14 d每组各取4只用于Western blotting检测。大鼠饲养至250～280 g，采用颈内动脉线栓法制备大脑中动脉阻塞（MCAO）脑缺血再灌注模型［2］。根据下列标准纳入研究：大鼠完全清醒后，出现右侧虹膜颜色变浅，瞳孔缩小，左侧偏瘫（左上肢明显），大鼠自主运动时，出现左转圈，提尾悬空时，左前肢屈曲、内收为模型成功。如未出现上述症状，予以排除。神经功能损伤评价参考改良Bederson 5分制法：0分为提尾悬空时，动物的两前肢均伸向地板方向，且无其他行为缺陷；1分为提尾悬空时，动物的手术对（左）侧前肢表现为腕肘屈曲、肩内旋、肘外展、紧贴胸壁；2分为将动物置于光滑平板上，推手术侧肩向对侧移动时阻力降低；3分为动物自由行走时，向手术对侧环行或转圈；4分为肢体软瘫，肢体无自发活动。0分及4分者予以排除。

1.4 干预方法 高剂量组（250 mg/200 g）、中剂量组（125 mg/200 g）、低剂量组（62.5 mg/200 g）于再灌注后，待大鼠清醒后灌胃给药1次，其后每日给药1次，假手术组、模型组灌胃给予0.9%氯化钠注射液，给药容积5 mL/kg。

1.5 神经功能测定 参照《现代神经科学研究方法》［3］采用神经功能缺损评分标准（NSS），于术后第1日、第7日和第14日对造模大鼠进行评价，0分为无任何异常行为；1分为提起鼠尾，健侧前肢内旋、肩内收为损伤较轻；2分为上述症状基础上，置于光滑平面，向健侧推挡时阻力减弱或动物转圈追尾爬行，为中度损伤；3分为提起鼠尾，向患侧旋转，损伤较严重；4分为动物处于精神抑制状态，不能进行自发活动。

1.6 GAP-43、β-TubulinⅢ蛋白表达的检测 根据动物福利的相关规定，所采取的处死方式为二氧化碳安乐处死方式。而后，断头取脑，取每组大鼠的右侧大脑皮层组织，应用 Western blotting检测 GAP-43、β-TubulinⅢ蛋白的表达。经转膜等程序后按1∶1比例配制ECL发光液，上机曝光检测。用Image Lab软件处理各条带的灰度值，用β-actin作内参，用目的蛋白与β-actin灰度值的比值作为目的蛋白的相对含量。

1.7 统计学处理 应用SPSS16．0统计软件。计量资料以（x±s）表示。Western blotting检测结果采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。然后用LSD进行组内两两比较，P＜0.05有统计学意义。不符合方差齐性检验的，对数据进行函数转换后再行单因素方差分析及LSD两两比较。绘图采用Grapthpad软件绘制。

2 结 果

2.1 各组NSS评分比较 见表1。假手术组无神经功能缺损，分别将低、中、高、模型组在第1日、7日、14日采用单因素方差分析，每组在各个时间点的NSS评分之间的差异无统计学意义（P＞0.05）。但低、中、高剂量组在第14日时均有改善神经功能的趋势，而模型组在第14日时的评分与术后第1日相比有所下降，但趋势并不明显，且在术后第7日评分有增高的趋势。

表1 各组NSS评分比较（分，x±s）

2.2 各组大鼠GAP-43、β-TubulinⅢ蛋白表达的比较见图1，图2，表2。1）各组GAP43蛋白表达比较：治疗7 d，各组间比较差异有统计学意义 （P＜0.05）。再经LSD多重比较，低、中、高、假手术组分别与模型组比较：低剂量组GAP43表达升高，差异无统计学意义（P＞0.05）；中剂量组 GAP43表达明显升高（P＜0.01）；高剂量组GAP43表达升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）；假手术组GAP43表达升高，无统计学意义（P＞0.05）。治疗14 d，各组间比较差异无统计学意义（P＞0.05），不再进行 LSD 多重比较（见表 1，图 1、图 2）。 2）β-TubulinⅢ蛋白表达比较：治疗7 d，各组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。再经LSD多重比较，低、中、高、假手术组分别与模型组对比：低剂量组Tubulin表达降低，无统计学意义（P＞0.05）；中剂量组Tubulin表达明显升高（P＜0.05）；高剂量组Tubulin表达明显降低（P＜0.05）；假手术组Tubulin表达升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗14 d，各组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），再经 LSD 多重比较，低、中、高、假手术组分别与模型组对比：低剂量组Tubulin表达升高，差异无统计学意义（P＞0.05）；中剂量组Tubulin表达明显升高；高剂量组Tubulin表达明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；假手术组Tubulin表达升高，无统计学意义（P＞0.05）。

图1 7 d时GAP-43、β-TubulinⅢ蛋白的表达

图2 14 d时GAP-43、β-TubulinⅢ蛋白的表达

3 讨 论

传统观念认为，成年中枢神经系统内只有神经元的死亡，没有再生。 1992 年，Reynolds等［4］首次从成年小鼠脑纹状体分离出神经干细胞，打破了神经细胞不能再生的传统观念，为神经系统的损伤及疾病的治疗提供了新思路。而神经再生主要是指神经干细胞增殖、迁移、分化整合入神经回路中生成具有功能的神经元。虽然近年来外源性神经干细胞移植被提出有望治疗中风后的神经损伤［5］，但涉及伦理及免疫排斥未得到解决，临床应用受限，内源性再生途径可避免外源性再生途径的相关问题，成为研究的热点，因此最大程度地激活内源性神经干细胞是治疗脑缺血后神经损伤的有效途径［6］。

表1 各组GAP-43、β-TubulinⅢ蛋白的表达水平比较（x±s）

GAP-43是一种广泛分布于神经系统内的特异性胞膜磷酸蛋白，主要沿神经元轴突表达，其在轴突生长锥的质膜和突触前终末表达明显，在生长、分化、再生的轴突末端含量极高，它与神经系统的发育、突触形成和可塑性以及神经再生密切相关［7］。在神经损伤和再生时，轴突内 GAP-43 的含量可增加 20～100 倍［8］。 国际上将GAP-43列为研究神经生长发育和损伤修复等神经可塑性的首选分子探针［9］。GAP-43在神经元的发育和再生过程，伴随着轴突生长在神经组织内大量合成，是神经再塑和再生的分子标志物。β-TubulinⅢ是微管蛋白家族的一种亚型，主要参与细胞骨架的构成，而细胞骨架与神经干细胞分化成神经元的过程相关，它不仅维持细胞形态，而且与细胞的运动、物质转换、能量转换、信息传递以及细胞分裂和分化、基因表达等重要生长活动相关［10-12］。β微管蛋白是神经细胞特异性微管蛋白，被认为是神经元发育的标志。

缺血性脑血管病主要因脑部血液循环障碍引起，蒲参胶囊主要应用于高脂血症的治疗，有较强的活血化瘀功能，对血液系统的调节有积极的作用。随着临床研究的深入，蒲参胶囊在脑梗死患者的运用价值也慢慢被挖掘。肖展翅等在蒲参胶囊对急性脑梗死临床研究中发现，蒲参胶囊除具有降低血脂作用外，还可降低血液黏度，降低颈动脉内膜厚度，减少颈动脉斑块大小和厚度，从而改善脑梗死患者微循环障碍［13］。何首乌补肝肾、益精血，蒲黄化瘀行血通经，丹参、川芎、赤芍、山楂均有活血祛瘀之功，泽泻利水渗湿，可泄水湿，行痰饮，党参补气补血生津。现代药理研究发现，川芎的有效成分之一川芎嗪对神经细胞及血管内皮细胞有抗凋亡作用，其另一有效成分阿魏钠能抑制血小板聚集［14］，丹参能强有力地使纤维蛋白原裂解为纤维蛋白降解产物（FDP），减少纤溶酶激活物的抑制物（PAI），加强纤溶。丹参还可通过增加超氧化物歧化酶的含量，清除氧自由基，促进神经功能恢复［15］，因此蒲参胶囊对缺血性脑血管病的防治具有一定的价值。

在本次实验研究中，笔者通过颈内动脉线栓法制备大鼠MCAO脑缺血再灌注模型，通过对第1、14日等观察点进行行为学评分，评价蒲参胶囊对脑缺血后功能恢复的情况，结果显示蒲参胶囊虽然对大鼠脑缺血后神经功能损伤的恢复有一定的改善趋势，但作用并不明显，可能与大鼠本身的梗死程度较重及观察时间周期短相关。Western blotting结果显示中剂量蒲参胶囊治疗7 d时可明显提高GAP-43和β-TubulinⅢ蛋白的表达，说明中剂量蒲参胶囊短期内即有效，起效迅速；治疗14 d，中剂量蒲参胶囊对β-TubulinⅢ蛋白的表达也有升高作用，具体用药疗程有待进一步研究探讨，治疗14 d，蒲参胶囊对GAP43的蛋白表达影响不明显。以上结果说明蒲参胶囊中等剂量在一定程度上可以促进脑缺血后的内源性神经再生，促进神经损伤的修复，但其量效关系还需进一步验证。

综上所述，蒲参胶囊在以往的临床应用中具有降低血液黏度，改善血管功能的作用，而本次的动物实验可初步证实蒲参胶囊可通过促进内源性神经再生，达到促进脑缺血神经功能损伤的恢复，为拓展中医药的用药范围及在神经再生领域的临床应用提供了理论基础和实验依据。