复元醒脑汤干预糖尿病脑梗死大鼠缺血脑组织血管新生的实验研究*

孙丽华 叶苗青 沈俊逸 闫 诏 解婉莹 方邦江（上海中医药大学附属龙华医院，上海 200032）

目前糖尿病并发急性脑梗死的发病率、死亡率和复发率较高，预后不良。糖尿病是脑梗死的独立危险因素，数据显示糖尿病患者的脑梗死风险比非糖尿病患者高出1.5～3倍［1］。但是糖尿病性脑梗死的发病机制十分复杂，涉及许多信号通路，包括糖脂代谢影响、内皮功能、氧化应激以及炎症反应等，迄今为止还尚未明确［2］。“复元醒脑法”治疗中风病是龙华医院急诊科作为国家级重点专科学科内涵建设三大特色之一，临床疗效显著。笔者在坚实的临床基础上，结合既往研究数据以及经验总结，认为复元醒脑汤对于糖尿病脑梗死组织的修复应该是多靶点调控的，故以干预损伤区域血管微循环系统的重建为切入点，进行机制研究。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取150只健康的成年SD大鼠，雌雄各半，体质量（250±25）g，购自上海杰思捷实验动物有限公司（实验动物合格证编号2008001671284），饲养于上海中医药大学附属龙华医院科技楼实验动物中心。

1.2 药物 复元醒脑汤：人参10 g（另煎），三七10 g，石菖蒲 12 g，水蛭 10 g，益母草 30 g，天南星 15 g，制大黄9 g（后下）。由上海市龙华医院制剂室生产提供，生药质量浓度为388 g/L。二甲双胍缓释片由正大天晴药业集团生产，国药准字H20031104。尼莫地平由正大青春宝药业有限公司生产，国药准字H33022285。

1.3 仪器及试剂 大鼠脑立体定位仪，深圳瑞沃德生命科技有限公司生产。扫描仪，明基电通有限公司生产。紫外分光光度计，北京长流科学仪器公司生产。低温高速离心机，Sanyo-Japan生产。恒压恒流电泳仪，北京六一仪器厂生产。凝胶成像仪，mersham Pharmacia Biotech生产。-80℃冰箱，Sanyo-Japan生产。脱水机，石蜡包埋机，石蜡摊片机，切片机，Leica-German生产。光学显微镜，摄像系统，Olympus-Janpan生产。电泳仪，转膜仪，BIO-BAD-USA生产。酶标仪，Thermo-USA生产。恒温摇床，上海精密仪器制造公司生产。化学发光成像系统，上海欧翔科学仪器有限公司生产。链脲佐菌素（STZ），凝血酶，Sigma-USA 提供。PMSF，Amresco-USA提供。RIPA裂解液，Beyotime Biotechnology提供。BCA蛋白分析试剂盒，Amresco-USA提供。SDS-PAGE凝胶，SDS-PAGE上样缓冲液，SDS-PAGE电泳液，定影液、显影液，均由Beyotime Biotechnology提供。

1.4 模型制备 将STZ试剂溶于pH4.6的柠檬酸钠缓冲液中（现配现用），大鼠腹腔注射STZ试剂（50 mg/kg），1周后制成糖尿病模型（随机血糖＞16.7 mmol/L），并连续高脂饮食饲养2周。在此基础上采用线栓法制备糖尿病脑梗死模型［3］。常规麻醉大鼠后，将大鼠以仰卧位固定于固定板上；剪去颈前的鼠毛，碘伏消毒，沿颈部正中部位切开皮肤和浅筋膜约2 cm左右。钝性分离皮下组织，沿胸锁乳突肌和颈前肌群肌间隙向深部分离，分离到气管前肌后，沿右侧胸锁乳突肌腱向下分离，见到颈动脉鞘后可上拉钩，分离动脉鞘，分离出颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，结扎颈总动脉的近心端，夹闭颈总动脉，夹闭颈内动脉并从颈内动脉插入线栓，然后进入颈外动脉直至进入中脑动脉，插入深度距颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉分叉约为18 mm。将线栓和颈外动脉通过缝线结扎并固定。将颈内动脉紧紧夹紧并切除额外的线栓线。成功后在线栓入口处结扎，缝合。缝合后，用酒精棉签消毒皮肤缝合线，将大鼠放回笼中，并在2 h后拉动线栓进行再灌注。在糖尿病组中，除未插入线栓之外，其余的手术过程与用于制备脑梗死模型的手术过程相同。

1.5 分组及给药 健康SD大鼠150只，在常规喂养后随机分为正常组30只与糖尿病模型组120只，糖尿病模型造模成功后，连续高脂饲料喂养2周，再将糖尿病模型组按每组均等例数随机分为糖尿病模型假手术组（简称糖尿病组，予正常饲养+0.9%氯化钠注射液）；糖尿病脑梗死大鼠模型组（简称模型组，予正常饲养+0.9%氯化钠注射液）；糖尿病脑梗死大鼠模型中药灌胃组（简称中药治疗组，予正常饲养+复元醒脑汤）；糖尿病脑梗死大鼠模型西药灌胃组（简称西药治疗组，予正常饲养+西药）4组。中药治疗组大鼠给予复元醒脑汤剂量 10.4 g/（kg·d），每日 2次。西药治疗组大鼠予二甲双胍 27 mg/kg，每日 2 次；尼莫地平 2.16 mg/（kg·d），每日2次（具体实验步骤和剂量参照陈琦的《中药药理实验方法学》［4］根据实验动物与体表面积的比值计算）。同时，模型组和糖尿病组给予等体积0.9%氯化钠注射液灌胃。正常组未进行干预，仅予常规喂养。连续灌胃14 d后处死取材。

1.6 标本采集与检测 1）大鼠血糖测量。通过大鼠尾静脉收集血液，并使用葡萄糖计和葡萄糖测试条在术前、术后7 d测量血糖水平。2）神经功能评分。各组术后24 h和7 d实验动物进行Bederson评分：尾部抬高使大鼠悬于空中测试，在大鼠的尾巴举起高度1 m处的状态下观察前肢的屈曲。0分为无缺陷。1分为对侧前肢屈肌功能缺损。2分为尾部握住时，对侧推和躯干转向同侧的阻力降低。3分为受影响侧旋转非常明显，受影响侧负重能力降低。4分为动物很少自发活动，喜欢躺下或休息。当分值大于或者等于1分的时候，表明实验动物模型制作成功。3）免疫组织化学染色检测大鼠新生血管的密度检测。新生血管的标记CD31进行免疫组织化学染色，石蜡包埋组织4 μm切片，常规二甲苯脱蜡。采用兔CD31免疫组化试剂盒，按说明书进行操作。3%过氧化氢溶液封闭约10 min，PBS液冲洗3次，每次3 min，正常羊血清工作液37℃封闭30 min，倾去工作液，滴加一抗4℃孵育过夜（用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照），PBS液冲洗3次，每次3 min，滴加二抗，37℃孵育15 min，PBS液冲洗3次，每次3 min，滴加链霉菌抗生物素-过氧化物酶，37℃孵育15 min，DAB显色，苏木素复染，常规脱水，树胶封片。阳性细胞呈棕黄色至褐色。4）透射电镜检测大鼠脑组织皮层的微血管超微结构。每组各取2只大鼠，深度麻醉后，置冰上迅速断头取脑，沿视交叉处前后1 mm切开，在缺血梗死周围皮质取大约1 mm3（1 mm×1 mm×1 mm）组织，置入4℃2.5%戊二醛固定液中约2 h，配制0.1 mol/L磷酸缓冲液漂洗3次并固定2 h或更长时间，4℃保存，移入1%锇酸固定液中固定2～3 h，0.1 mol/L磷酸缓冲液漂洗3次。经脱水、包埋、固化、超薄切片机50～60 nm切片、3%醋酸铀-枸橼酸铝双染色、透射电镜观察并拍片。

1.7 统计学处理 数据统计应用版本为Windows v.17的SPSS统计软件。计量资料以（x±s）表示，数据采用双因素方差分析，组间的差异性检测post hoc分析采用LSD-t。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠血糖水平比较 见表1。术前糖尿病组、模型组、中药治疗组和西药治疗组大鼠与正常组比较，血糖均升高（均P＜0.01）。术后7 d中药治疗组与模型组比较，血糖降低（P＜0.05）；西药治疗组与模型组比较，血糖亦降低（P＜0.05）。中药治疗组与西药治疗组比较，差别不大（P＞0.05），表明无论是复元醒脑汤的中药治疗还是西药治疗均能降低血糖水平。

表1 各组大鼠术前术后血糖比较（mmol/L，x±s）

2.2 各组大鼠Bederson评分比较 见表2。手术后7 d正常组和糖尿病组大鼠Bederson评分为0分；模型组、中药治疗组和西药治疗组与正常组比较，Bederson评分均升高（均P＜0.01），表明与模型组、中药治疗组和西药治疗组大鼠仍有一定程度的神经缺损。中药治疗组、西药治疗组与模型组比较，Bederson评分均降低（均P＜0.01）；中药治疗组与西药治疗组Bederson评分比较，差别不大（P＞0.05），表明无论是复元醒脑汤的中药治疗还是西药治疗均能显著改善糖尿病脑梗死所导致的神经缺损。

表2 各组大鼠Bederson评分比较（分，x±s）

2.3 各组大鼠缺血脑组织部位血管新生变化 见图1。正常组血管丰富，血管壁较厚，管腔充满；糖尿病组血管管壁较薄，管腔较厚，血管数量少，管腔受损。西药治疗组血管壁增厚。中药治疗组壁增厚有一定程度的血管生成，管腔增加。结果表明，中药治疗组和西药治疗组均对糖尿病性脑梗死的血管生成有影响，中药治疗组优于西药治疗组。

图1 各组脑微血管内皮细胞CD31的表达（免疫组化染色，400倍）

2.4 各组大鼠脑皮层微血管超微结构的变化 见图2。使用透射电镜检测各组血管的基底膜状态。结果表明，糖尿病组、正常组大鼠未见水肿及结构破坏，但糖尿病组存在基底膜变薄现象；糖尿病组大鼠出现基底膜节段性不清甚至溶解、缺损，管腔缩小；中药治疗组、西药治疗组大鼠脑微管超微结构的变化整体较糖尿病组有所改善。

3 讨 论

脑梗死是严重危害人类健康的主要疾病之一，临床数据显示糖尿病会增加罹患脑缺血的风险，例如缺血性脑卒中或心血管疾病［5-6］。糖尿病能加重脑血管疾病造成的损害，包括氧化应激，白细胞功能受损，增加血脑屏障的渗透性以及炎症反应等一系列的血管病变，包括增加血管通透性而大大增加缺血性中风的发病率［7］。事实上，脑梗死发生时，脑组织由于血管舒张功能受损导致脑血流量持续下降而引起神经细胞死亡，机体将通过血管再生对缺血半影区进行调节及重建功能性微血管系统从而维持神经功能，并且为神经元可塑性创造一个良好的微环境以利于其功能恢复［8］。

图2 各组脑微血管超微结构的比较（3%醋酸铀-枸橼酸铝双染色，10 000倍）

近年来，业界普遍认同糖尿病脑梗死消渴并中风病病机主旨在于 “气虚为其根本、标瘀痰阻络为其标实”，消渴并中风病的基本治则以“补虚活血、祛痰通络”为主。方邦江教授根据临床中“消渴中风病”的病机特点，总结前人治疗急性脑血管病的经验，创新性提出了“复元醒脑法”，以培植元气为根本大法，以逐瘀泄痰、祛热息风、通络为辅，并自拟复元醒脑汤（人参、石菖蒲、天南星、三七、水蛭、益母草、大黄）治疗中风病取得良好临床疗效。方中人参培补中元之气，补益脾肺清气，为治本之君药；天南星息风清热，定惊化痰；石菖蒲性芳香化浊祛痰、开脑窍，天南星与石菖蒲相互配合共为臣药治疗风痰交阻脑窍之症；三七与水蛭并用为臣药活血止血，力专善走窜，周行全身经络。益母草为佐药尤擅活血利水祛风，方小力专；大黄为使，清热兼解毒，通腑泻下化瘀，使瘀、痰、热、风等有形和无形实邪得以出路；诸药合用，共奏醒脑复神、逐瘀泄痰、祛热息风之功。实验研究显示，复元醒脑汤能够治疗中风病的机制可能在于在脑梗死中可调整胰岛素敏感相关指数，干预胰岛素抵抗这一难题。有效保护和减少再灌注损伤对血-脑屏障造成的二次打击和伤害，降低血-脑屏障的通透性，缓解脑水肿病变进展的程度，减轻大脑皮层神经细胞的肿胀程度，减轻微血管内皮细胞的损伤，改善炎性细胞浸润，进而改善神经缺损行为评分，促进建立损伤区域局部神经与血管的新生和侧支循环重建［9-15］。

本次实验笔者通过大鼠血糖水平、Berderson评分、透射电镜观察各组血管基底膜状态等方面综合评估糖尿病并发脑梗死动物模型。结果证实复元醒脑汤和西药组均改善了糖尿病脑梗死大鼠的血糖水平，糖尿病脑梗死的主要病理特征是由于供血不足所导致的组织梗死以及梗死中心周围组织的缺氧缺血，所以重建血管以恢复血液循环对于脑梗死后的糖尿病缺血性脑组织十分重要。CD31作为血管内皮细胞新生的重要标志［15］，通过免疫组化染色显示糖尿病脑梗死组织血管管壁断裂，内皮细胞受损，管腔缩小，复元醒脑汤治疗后，糖尿病脑梗死大鼠缺血区新生血管数增多，血管壁较完整，血管直径增厚。除此之外，笔者使用透射电镜检测了各组血管基底膜状态，可以观察到糖尿病组、正常组大鼠血管结构未见明显破坏，但糖尿病组存在基底膜变薄现象；模型组大鼠出现基底膜节段性不清甚至溶解、缺损，管腔缩小；中药治疗组、西药治疗组大鼠脑微管超微结构的变化整体较糖尿病组有所改善。基于上述结果笔者认为复元醒脑汤能降低糖尿病脑梗死大鼠模型的血糖水平，能够上调血管内皮CD31的表达，促进血管生成，改善脑微血管超微结构，从而缓解糖尿病合并脑梗死进展，改善大鼠神经功能缺损行为评分，为临床工作提供了重要参考，具有广泛的应用前景和非常重要的科学研究意义。