昆明滇池红嘴鸥粪便细菌分离鉴定与耐药性分析

李 娟 杨 勇 李 朝 鲁红林 肖望成黄翠琴 段 纲 曾邦权 段博芳 代飞燕*

(1.云南省高校兽医公共卫生重点实验室，云南农业大学动物医学院，昆明，650201；2.昆明市濒危动植物收容拯救中心，昆明，651700；3.福建省家畜传染病防治与生物技术重点实验室，龙岩学院生命科学学院，龙岩，364000；4.云南省动物疫病预防控制中心，昆明，650201)

红嘴鸥(Chroicocephalusridibundus)是分布于欧亚大陆和北美洲东部沿海的一种候鸟，在欧亚大陆繁殖，到非洲北部、印度、菲律宾和日本一带越冬。在中国其繁殖地在新疆、内蒙古、黑龙江、吉林等地，而越冬地却很广阔，北起东北地区的南部，西抵西藏南部，东至台湾，沿海各省常见[1-2]。昆明位于我国西南部，北纬纬度低，处于亚热带高原季风气候地区，同时受到印度洋西南暖气流的影响，所以年温差小，年平均气温15℃左右，这样的一个环境便吸引了红海鸥的到来，每年11月至次年3月来云南过冬，绝大部分栖息在昆明滇池水域，另外昆明翠湖和大观河、大理洱海等地有零星分布。每年冬天，有红嘴鸥的地方就是亮丽的风景，深受昆明人的喜爱，也吸引着全国各地来观光的旅客。但是红嘴鸥在迁徙过程中，难免会感染某些传染性疾病或携带着某些病原菌，而这些病原菌是否会通过与红嘴鸥亲密接触后导致人群被感染，又或者是红嘴鸥的粪便污染了水源然后导致一些细菌性传染病暴发流行，所以针对红嘴鸥是否有携带病菌的研究尤其重要。本研究对红嘴鸥腹泻粪便进行细菌分离鉴定，以期找到至其腹泻的病原，为采取保护措施提供科学依据，并为习惯与红嘴鸥亲密嬉戏的游人提供安全的公共环境。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验样品及试验动物

采集云南昆明滇池水域红嘴鸥腹泻粪便棉拭子10份。

1.1.2 主要仪器

MCV-131BNF无菌超净台、MLS-3020高压灭菌器、MOV-212电热恒温干燥箱(SANYO/日本)、恒温培养箱、电子分析天平(上海)。

1.1.3 培养基

根据禽类肠道正常菌群的特点，选用肉汤培养基、血清普通琼脂培养基、 LB琼脂培养基、伊红美蓝(EMB)琼脂培养基、麦康凯培养基等选择培养基(购自上海生工生物试剂有限公司)。

1.2 细菌分离

在无菌条件下，将粪便样本，接种到普通肉汤培养基(北京陆桥技术有限责任公司)中，放入37℃摇床培养12 h。吸取菌液1 mL进行10倍梯度稀释，取108稀释的菌液200 μL，涂布在鲜血琼脂培养基(北京陆桥技术有限责任公司)上，放入培养箱中37℃培养24～48 h。挑取肉眼能区分出的表征各异的菌落，在营养琼脂培养基(北京陆桥技术有限责任公司)上画线接种，并进行纯化培养。37℃培养15～24 h后对细菌进行革兰氏染色，并记录菌株的形态。根据细菌在营养琼脂培养基上的不同表征及革兰氏染色结果，对分离到的细菌进行初步分类。计算每类细菌的检出率，即存在某一类细菌的样品数占总样品数的百分比。

1.3 生化鉴定

挑取纯培养的单菌落到生理盐水管中，调节麦氏度为0.5，吸取0.5 mL菌液接种于细菌生理生化鉴定管(北京陆桥技术有限责任公司)中，放入培养箱37℃培养24～38 h，判定结果，判定依据为《常见细菌系统鉴定手册》[3]。

1.4 分子生物学鉴定

利用细菌16S rDNA基因通用引物(上游引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，分离纯化细菌后，参照细菌基因组DNA试剂盒(天根生物科技有限公司)说明书提取细菌总DNA，利用细菌16S rDNA通用引物扩增16S rDNA基因片段。以新鲜培养的菌液为模板，采用细菌16S rDNA通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ 和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′(引物均由上海生工生物科技有限公司合成)进行PCR扩增。对菌株的16S rDNA进行PCR扩增。PCR反应体系25 μL，预混DNA聚合酶12.5 μL，模板1 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s，共30个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。阳性对照中，模板为实验室保存的大肠埃希菌(Escherichiacoli)菌株的DNA；阴性对照中，模板为ddH2O。分别取5 UI PCR产物和DL2000 Marker(大连宝生物工程有限公司)，用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。取PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，根据通用型DNA纯化回收试剂盒说明书回收目的条带。将胶回收产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序结果提交到NCBI的BLAST检索系统进行序列比对，找到同源性最高的几个序列，确定分离细菌属，寻找同源性最高的细菌，下载该属的序列，用Mega 6.0构建系统进化树。并采用邻接法(neighbor joining method)构建系统发育树。

1.5 药敏试验

采用药敏纸片琼脂扩散法(K-B法)，将麦氏度为0.5的菌液均匀涂在普通琼脂培养基(北京陆桥技术有限责任公司)上，贴上12种药敏纸片(杭州滨河微生物试剂有限公司)，药敏纸片上分别含有抗生素氨苄西林、头孢氨苄、头孢拉啶、庆大霉素、卡那霉素、阿米卡星、四环素、氯霉素、环丙沙星、恩诺沙星、磺胺异恶唑、头孢曲松钠。将贴有药敏纸片的培养基，放入培养箱中35°C培养16～18 h后测量抑菌圈直径，并依据纸片法抗菌药物敏感试验标准(WS/T125-1999，中华人民共和国卫生部2000)判定结果。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922，若质控菌株药物敏感度正常，则药敏试验的结果可靠。

2 结果

2.1 细菌分离纯化

从10份粪便样品中共分离出70株细菌，将分离菌在营养琼脂上划线培养后，根据其在营养琼脂上的不同表征及革兰氏染色结果，对分离到的细菌进行初步分类，得到6类细菌，其在营养琼脂上的生长情况见图1(顺序依次为1/2/3/4/5/6号菌)。从6类细菌中各挑取1株典型细菌进行纯化鉴定，革兰氏染色结果、在营养琼脂上的培养性状以及检出率见表1。

2.2 分离菌的生化鉴定

对6株细菌进行生化鉴定，生化鉴定结果见表2。1～6号细菌分别为埃希氏(Escherichia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、志贺氏菌属(Shigella)、沙雷氏菌属(Serratia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)的生化指标一致，故初步判定1～6号细菌分别属于上述6个属。

2.3 16S rRNA鉴定结果

对6株分离菌的16S rRNA进行扩增之后，用1.0%琼脂糖凝胶对产物进行检测(图2)。6个样本均得到明亮的电泳条带，且大小在1 500 bp左右，与预期大小相符，可用于测序。将测序结果在Genbank中进行相似性比对，并用测序获得的16S rRNA序列构建了系统进化树(图2)，判定出6株分离菌分别为大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、痢疾志贺氏菌(Shigelladysenteriae)、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)和产酸克雷伯菌(Klebsiellaoxytosus)，与生化鉴定结果一致。

图1 6种分离菌在营养琼脂培养基上的生长情况Fig.1 Six isolated strains grown on nutrient agar medium

表1 分离菌的革兰氏染色结果、菌落形态特征及检出率

Tab.1 Gram dyeing，culture shape and detection rate of isolated bacterial strains

表2 分离菌株生化鉴定结果

Tab.2 Biochemical identification results of isolated strains

续表2

注：“+”为阳性反应，“-”为阴性反应

Note：“+”means positive，“-”means negative

2.4 药敏试验

对6株分离菌进行药敏试验显示，大肠埃希菌对阿米卡星高敏；金黄色葡萄球菌对庆大霉素高敏；屎肠球菌对万古霉素高敏；志贺氏菌对阿米卡星高敏；粘质沙雷氏菌对环丙沙星敏感；产酸克雷伯菌对恩诺沙星敏感。6种分离菌种对其余抗生素具有不同程度的敏感性(表3)。质控菌株药物敏感度正常。

图2 16S rRNA系统进化树Fig.2 16S rRNA phylogenetic tree

表3 分离菌株药敏试验结果

Tab.3 Antibiotic resistance test of the isolated bacterial strains

注：抑菌圈的直径≥20 mm为极敏感，15～20 mm为高度敏感，10～14 mm为中度敏感，10 mm以下且>0为低度敏感，等于0则为不敏感

Note：Diaphragm diameter≥20 mm extremely sensitive，15-20 mm highly sensitive，10-14 mm moderately sensitive，diaphragm diameter<10 mm，diaphragm diameter>0，low sensitivity，=0 not sensitive

3 讨论

从10份滇池地区腹泻红嘴鸥粪便中分离到70株细菌，对其进行形态学观察并分类，根据其生化特性及16S rRNA鉴定结果，鉴定出6种细菌。其中大肠埃希菌[4]、志贺氏菌[5-6]、肠球菌[7-8]、粘质沙雷氏菌[9]、产酸克雷伯菌[10-11]是重要的条件致病菌。

当机体免疫力下降时，这些细菌就会侵染机体，引起机体感染或死亡，对机体构成严重威胁[7]，大肠杆菌引起腹泻从已有的流行病学调查资料看[4]，我国也存在散发病例，主要表现为感染性腹泻是近几年新发现的危害严重的食源性疾病。越来越多的流行显示其与食用水和蔬菜有关，而很多的流行情况都是因为带菌动物的粪便传播，大肠杆菌能够长期存在动物体内，并且不断向外界排菌，对周边环境和动物的胴体造成污染，严重影响了人类的身体健康，威胁人们的生命。

金黄色葡萄球菌在自然界中分布广泛，多种禽类都可感染金黄色葡萄球菌。金黄色葡萄球菌的主要传播途径为创伤，也可通过消化道和呼吸道感染[12]。

志贺氏菌常引发细菌性痢疾，通称为痢疾杆菌，并且其在自然界中分布较为广泛，是人和灵长类动物的肠道致病菌，经常会导致细菌性痢疾，具有高度传染性，对人类和动物健康造成严重的影响[13]。人类对志贺氏菌易感。一般说来，志贺氏菌所致菌痢的病情较重；排菌时间长，易转为慢性。这样患病动物携带致病菌，更容易通过粪便污染水源，进而威胁到人类健康。志贺氏菌能够在潮湿土壤中生存34 d，37℃水中生存20 d，在粪便内(室内温度)生存11 d，滇池水域是昆明最大的流动水域，在此水域中存在的志贺氏菌对昆明市民的健康有极大的威胁。

在自然界环境中，沙雷氏菌广泛分布于水和土壤中。而水作为沙雷氏菌的主要生存环境之一，分离出很多种属的沙雷氏菌，如普城沙雷菌(Serratiaplymuthica)、液化沙雷氏菌(Serratialiquefaciens)、根际沙雷氏菌(Serratiaesseyan)等都分离自水中[10]。有相关研究报道指出，对河水中的沙雷氏菌进行分离统计后发现，其中粘质沙雷氏菌占75%[14]。沙雷氏菌菌株是脊椎动物的机会性病原菌，由于很少有关于沙雷氏菌感染畜禽或野生动物的报道[15]，以致兽医界对于沙雷氏菌的重视远不及人医，但是仍有个别案例显示沙雷氏菌能感染鳄鱼等爬行动物，造成皮下脓肿，馈痕等症状[15]。同样有少部分案例显示，沙雷氏菌能感染哺乳动物，造成奶牛乳腺感染[16-17]，以及造成部分牲畜患败血症等[18]。

产酸克雷伯菌可导致人畜患病，常引起腹泻和食物中毒[15-16]。

从滇池地区腹泻红嘴鸥粪便中分离到6种不同的病原性细菌，极有可能与鸟只腹泻有关。可能是由于红嘴鸥在迁徙停歇地接触受污染的农田、垃圾等，导致其摄入含有细菌的食物，其携带的细菌在机体免疫力下降时侵入机体，而这些菌株也可随着红嘴鸥的迁徙，扩散到更广泛的地区，并对人类和野生动物的健康、鱼类养殖业等产业造成潜在的威胁。因此，调查红嘴鸥携带致病菌和耐药菌株的情况，对野生动物疫病的监测与防控，以及对人类健康和野生动物的保护具有重要意义。