重庆动物园大熊猫血液生理生化指标的测定及分析

余昌萌 余 瑶 吴登虎 周 俊* 叶兵兵

(1.四川民族学院，康定，626001；2.陆军军医大学第一附属医院，重庆，400038；3.重庆动物园，重庆，400050)

自20世纪60年代初，重庆动物园圈养大熊猫(Ailuropodamelanoleuca)已有约60年历史，在此期间重庆动物园开展了多次野外救护大熊猫的工作，先后救护了50～60只大熊猫，最多的时候，动物园内大熊猫数量多达20只。如今，重庆动物园内现存大熊猫12只，已成为圈养大熊猫数量最多的城市动物园之一。截至2016年7月，重庆动物园共繁殖大熊猫20胎25只，成活15只，其中双胞胎5胎；2016年7月11日“兰香”顺利产下的龙凤胎“渝宝”“渝贝”也是重庆动物园繁殖大熊猫以来，双胞胎同时存活的首例。

近年来，随着科研事业的发展，在大熊猫繁育学、营养学、行为学及兽医学等方面取得了较为显著的成果，大熊猫血液参数俨然成为临床兽医及动物管理者对大熊猫进行健康评估的最基本评判指标。由于受到地域差异、种群数量及样品收集方式等多方面的限制，国内外对于大熊猫血液学系统的报道较为有限；李才武[1]、李光汉等[2]、王强等[3]和 Chen等[4]早年发表了一些关于圈养大熊猫的血液生理生化参数，但以往采取动物血液多数是在麻醉情况下进行的[5]，已有多篇报道相继指出麻醉对动物有较大的应激反应，且对血液的某些生理生化指标产生了较大影响[6]。为了建立非干扰状态下大熊猫正常生理生化指标的参考范围，成都大熊猫繁育研究基地于2017年首次报道了有关大熊猫的50项在非干扰状态下血液生理生化指标的正常参考范围。由于血液生理参数不仅受到遗传因素的影响还受到环境因素的影响[7]，成、渝两地及其他各地之间存在着较大的差异，大熊猫血液可能因环境气候、饲养方式等因素使得各项指标有所差异。因此该篇报道中的参数指标更适用于成都地区圈养大熊猫种群健康水平的评估[8]。

重庆动物园为了建立适用于本地大熊猫在非麻醉状态下正常生理生化参考范围，在经过长期驯化之后，选取了本园内可获得的9只健康大熊猫作为实验对象，共采得54个血样分别进行了58项常规血液学指标检测。本次研究就现有数据进行统计学分析，建立了重庆动物园大熊猫在非麻醉状态下血液生理生化指标的正常参考范围，不仅有助于兽医对大熊猫的健康状态进行有效的评估，及早发现隐情，还有利于动物管理者的日常管理工作，同时又为其他大熊猫饲养机构提供了可靠的参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 受试动物

本次受试动物均由重庆动物园饲养，年龄为2～35岁不等，具体性别及年龄分组见表1，具体个体信息见表2。所有受试动物在受试期间精神状态、吃食状态及大小便均正常者视为健康个体，并在采血前2周提前进入特别观察期。在此期间大熊猫进行正常的投食、驱虫、疫苗注射及行为训练工作。大熊猫的分组是根据性成熟状态进行的，将未参与交配的(5岁以下)视为亚成体(含幼体)大熊猫，参与交配的(5～20岁)视为成年大熊猫，20岁以上者视为老年大熊猫[6]。

表1 受试大熊猫年龄与性别分组

Tab.1 Age and sex groups of giant pandas

表2 大熊猫个体信息

Tab.2 Giant panda personal information form

续表2

1.1.2 仪器设备

实验仪器包括：(1)离心机：TD-5M-1台式低速离心机。(2)血常规检测仪：XT-2000(SYSMEX，日本)。(3)生化检测仪：VIROS5600(SYSMEX，日本)。

1.2 试验方法

1.2.1 采样方法

通过长期的行为训练，使大熊猫自愿伸出左上肢或者右上肢，剔除其前臂皮毛暴露静脉血管，用一次性静脉采血针(规格mm：0.7×25)和真空采血管进行血液采集工作。所获血样低温保存，1 h之内进行血液生理生化指标检测。

1.2.2 检测方法

将所有血样分为2份，1份为EDTA抗凝管，1份为无抗凝剂离心分离血清(4 000 r/min 10 min)，送往重庆市西南医院进行正常生理生化检测。

1.2.3 统计分析

所得数据通过SPSS(IBM SPSS Statistics 22.0)进行统计分析。将各个受试动物在同一年龄段的所有血液检测结果平均所得的平均值作为该受试动物在此阶段的最终检测值。血液生理生化的正常范围将通过平均值、标准差及个体数量体现，即每个受试动物先按照年龄组分别进行平均值和标准差计算，将超过平均值±3×标准差的数据不再进行之后的计算和检测[8-9]。将符合正态分布的数据进行T检验，不符合正态分布的进行非参检验。

2 结果

本研究共检测得重庆大熊猫血液正常生理生化指标参考范围58项(表3)，根据年龄(表3)、性别(表4)、地域(表5)等的不同，分组统计分析，其结果如下。

2.1 不同年龄段之间进行T—独立样本检验，部分指标呈现显著性差异，主要表现为：(1)幼年组与成年组：单核细胞、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、钙、磷、甘油三酯等指标呈现显著性差异(P<0.05)；平均红细胞体积、平均血红蛋白含量、碱性磷酸酶等指标呈现极显著性差异(P<0.01)。(2)幼年组和老年组：平均红细胞体积、平均血红蛋白含量、中性粒细胞、单核细胞、谷丙转氨酶、总蛋白、球蛋白、白球比值、总胆汁酸、乳酸脱氢酶、钙、葡糖糖、镁、高密度脂蛋白胆固醇等指标呈现显著性差异(P<0.05)；白细胞、碱性磷酸酶等指标呈现极显著性差异(P<0.01)。(3)青年组与老年组：淋巴细胞、总蛋白、球蛋白、钙、磷、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇等指标呈现显著性差异(P<0.05)；白细胞、中性粒细胞等指标呈现极显著差异(P<0.01)。

2.2 不同性别之间经T—独立样本检验分析，除肌酐有显著性差异外，其余指标均未呈现出显著性差异；再经方差齐性检验分析，其中谷草转氨酶、谷氨酰转移酶等呈现显著性差异(P<0.05)，碱性磷酸酶、直接胆红素、尿酸、肌酐、磷、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇等指标呈现极显著性差异(P<0.01)。再将其进行非参检验中的2 independent samples检验分析，除乳酸脱氢酶有显著性差异外，其余指标仍未出现显著性差异。

2.3 成、渝两地之间进行T—单个样本检验分析比较，主要表现为：(1)幼年组：谷丙转氨酶、白蛋白、白球蛋白比值、总胆红素、直接胆红素、乳酸脱氢酶、钠、尿素、尿酸、肌酐、葡萄糖、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、红细胞、平均红细胞体积、平均血红蛋白含量、红细胞体积分布宽度(CV)、红细胞体积分布宽度(SD)、淋巴细胞百分比、中性粒细胞百分比、嗜碱性粒细胞百分比等指标呈现极显著性差异(P<0.01)；碱性磷酸酶、球蛋白、钾、氯、钙、总胆固醇、白细胞、血红蛋白等指标呈现显著性差异(P<0.05)。(2)平均红细胞体积、平均血红蛋白含量、平均血红蛋白浓度、中性粒细胞百分比、淋巴细胞百分比、单核细胞百分比、红细胞体积分布宽度(CV)、红细胞体积分布宽度(SD)、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、白蛋白、总胆红素、直接胆红素、乳酸脱氢酶、尿酸、肌酐低密度脂蛋白胆固醇等指标呈现极显著性差异(P<0.01)；碱性磷酸酶呈现显著性差异(P<0.05)。(3)老年组：平均红细胞体积、平均血红蛋白含量、中心粒细胞百分比、淋巴细胞百分比、嗜碱性粒细胞百分比、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、白球比值、总胆红素、直接胆红素、乳酸脱氢酶、尿素、磷等指标呈现极显著性差异(P<0.01)；白细胞、单核细胞百分比、红细胞体积分布宽度(SD)、白蛋白、球蛋白、钠、氯、尿酸、肌酐等指标呈现显著性差异(P<0.05)。

表3 幼年、成年和老年组大熊猫生理生化指标

Tab.3 Hematologic and biochemical reference of infant、adult and aged giant pandas

续表3

注：针对常用血液生理生化指标进行差异性检验，标有相同字母的为差异不显著(P>0.05)，标有不同字母的为差异显著(P<0.05)，未标字母的未进行差异性检验

Note：For the difference test of commonly used blood physiological and biochemical indicators，the difference with the same letter is not significant(P>0.05)，the difference with different letters is significant(P<0.05)，and the unmarked letter is not tested differently

表4 雌性、雄性大熊猫生理生化指标

续表4

表5 成、渝两地比较

Tab.5 Comparison between in Chongqing and in Chengdu

续表5

续表5

注：该表中成都大熊猫数据参考于罗娌先前报道数据，标有**的为极显著差异(P<0.01)，标注*的为显著性差异(P<0.05)，未标注的无显著性差异

Note：The Chengdu giant panda data in this table refers to the data previously reported by Luoli.The marked**is a very significant difference(P<0.01)，and the marked*is a significant difference(P<0.05).There is no significant difference

3 讨论

3.1 本研究就重庆动物园内可获得的9只大熊猫进行了首次较为系统的非麻醉状态采血，并详细报道了非麻醉状态下圈养大熊猫不同年龄段和不同性别的血液生理生化指标参考范围。本研究完全排除了麻醉这一应激原，且均在各只大熊猫正常健康状态下进行，所得数据能够真实地反映大熊猫血液各项指标的实际检测结果，为兽医及研究工作者对大熊猫进行健康评估提供更为可靠的评判依据。

3.2 不同年龄组血液生理生化指标比较

不同年龄组血液生理生化指标体现为：(1)随着年龄的增长部分血液指标表现为幼年较低，成年后增长到峰值，老年后维持不变或有所下降，如血红蛋白、肌酐、直接胆红素、谷丙转氨酶、甘油三酯及总胆固醇等，其中各类酶波动较大，主要是由于酶容易受到应激、饮食、剧烈运动等的干扰。(2)随着年龄的增长部分血液指标如钙、磷、碱性磷酸酶等表现为呈现逐渐下降趋势。其主要原因是幼年动物处于一个迅速生长阶段，而碱性磷酸酶是能够反映骨形成及成骨细胞代谢活性的一个重要指标[8]。(3)随着年龄的增长至成年时期，部分血液指标如白细胞数目、淋巴细胞数目等略呈下降趋势，而到了老年时又逐渐上升；部分血液指标如血红蛋白、血小板等在幼年期时最低，成年后趋于稳定，而到老年时又开始逐渐下降。

3.3 不同性别之间血液生理生化指标比较

将所得数据进行T检验和非参检验中的2 independent samples 检验均得出雌、雄个体之间血液指标差异不显著，与王强[3]等所报道的结果一致，但其平均值及方差结果相差较大。主要表现为白细胞数目、淋巴细胞、血小板、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇等雌性个体均高于雄性个体，这与Mainks等[10]、罗娌等[8]所报道结果一致。因此，临床上对不同性别的大熊猫应给与区别对待。

3.4 成、渝两地圈养大熊猫血液生理生化指标比较

本研究结果发现部分指标与李光汉等[2]、王强等[3]和罗娌等[8]曾报道过的成都圈养大熊猫血液正常生理生化指标表现出一定程度的差异，主要体现为：(1)反映动物营养状况的各项指标如总蛋白、白蛋白、血红蛋白等表现为略低。(2)反映动物肝功的各项指标如总胆红素、总间接胆红素和直接胆红素等表现为各年龄段指标普遍高于罗娌等[8]所报道的，但与王强等[3]报道的无明显差异。(3)反映肾功的各项指标如尿素、尿酸和肌酐等表现为各年龄段指标普遍低于之前报道水平。(4)其他指标如总胆固醇、甘油三酯等均低于之前报道水平。各项血液生理生化指标虽反映着动物机体状况，出现较大的差异不仅受到动物性别、年龄、生活环境及营养水平的影响，还受到测定方法以及动物采食、运动、应激等多方面因素的影响，如营养物质丰富，营养水平良好时将表现为血液中胆固醇和甘油三酯含量偏高[11]；当机体处于应激状态时将表现为球蛋白偏高，白蛋白、球蛋白严重倒置[12]等。

本文就所得研究结果与罗娌[8]等所报道的结果通过T—单个样本检验对不同年龄段的指标进行统计分析发现，不同年龄段之间均有指标表现为极显著性或显著性差异，主要体现在平均红细胞体积、平均血红蛋白含量、中心粒细胞百分比、淋巴细胞百分比、嗜碱性粒细胞百分比、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、白球比值、总胆红素、乳酸脱氢酶、尿素、磷等指标呈现极显著性差异(P<0.01)；白蛋白、球蛋白、肌酐等指标呈现显著性差异(P<0.05)。导致差异性的原因可能是成、渝两地环境气候、管理方式及个体数目等的不同。具体分析如下：(1)成、渝虽同处四川盆地，但分处东西两端；虽均属亚热带季风性气候，但两地夏季气候相差较大，成都较重庆气温普遍偏低。成都海拔落差大而且昼夜温差大，对动物生理机能影响较大，如温度较高可能致使动物组织细胞受到氧化损伤，膜受到破坏，通透性增加，导致血清中乳酸脱氢酶、肌酸磷酸激酶、碱性磷酸酶和谷丙转氨酶等活性明显增高，致使各项酶指标波动较大，出现较大差异性；除此之外，动物的采食量也将受到影响，有所下降[13]，以致动物营养物质摄入不全，可能导致反映营养状况的各项指标如白蛋白、血红蛋白等呈现显著性差异。(2)饲养方式不同，主要体现于饲料搭配方面，据报道粗料种类对大熊猫血液生化指标影响较大[14]，如竹笋和竹叶的蛋白质营养价值较高，搭配不当可能导致蛋白质摄入过量，碱性磷酸酶、总蛋白、总胆红素含量升高，造成胆红素排除受阻等；精料搭配不当是可能造成血糖、甘油三酯等含量升高，对大熊猫造成疾病隐患，应加以重视，注意粗、精饲料合理搭配。(3)受试个体有限，本次研究受试动物只有9只，与成都地区大熊猫个体数目相差较大。在个体数目较少的情况下，可能导致平均值、标准差较大，以至于参考值范围增大，存在一定程度的误差，但是由于重庆地区大熊猫一类野生动物的系统数据较为罕见，本次研究所得结论仍具有一定的参考价值。

血液是动物机体主要的流动运输系统，它可以帮助完成一系列组织细胞间的物质交换，对维持机体内环境稳定具有重要意义。动物血液生理生化指标是反映动物机体健康状态的重要指标，也是疾病诊断及监控的重要评估手段。本文较系统地报道了重庆动物园圈养大熊猫在非麻醉状态下血液正常生理生化指标的参考范围，有利于动物管理者对大熊猫进行更加准确的健康评估、疾病诊断及监控，更有助于维持和发展重庆地区圈养大熊猫的健康种群。

致谢：感谢重庆动物园提供实习机会，开展本研究课题；感谢重庆动物园每一位饲养员辛勤工作，对每一只受试大熊猫进行驯化，使课题得以顺利开展；感谢周俊、王晓佳提供采血技术支持；感谢西南医院余瑶提供仪器及检测技术支持；感谢叶兵兵、吴登虎等给予的宝贵修改意见并对文章中所有引用文献作者表示由衷的感谢。