丝素蛋白/羟基磷灰石/聚多巴胺/BMP-2多孔支架的构建及促进BMSCs成骨分化的研究

刘 勇，张云庆，邬丹莲

丝素蛋白（silk fibroin，SF）复合羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）多孔支架具有良好的生物学相容性、力学性能和骨传导能力，但骨诱导能力不足[1]。骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）-2是目前已知最强的成骨活性因子之一，能够显著提高材料的成骨能力[2]，但制备BMP-2复合材料时传统物理吸附或包裹方法存在结合率低、易早期爆释的现象，难以满足骨形成过程中的持续需求[3-4]。近年来有学者在材料表面构建聚多巴胺（poly dopamine，PDA）涂层，不仅提高了材料的生物相容性，还能高效结合并缓释生长因子，为制备具有生物活性的组织工程骨提供了途径[5]。本研究采用冷冻干燥法制备SF/HA 多孔支架，在其表面形成PDA 涂层，然后接枝BMP-2，构建类似天然骨成分、结构和生理功能的SF/HA/PDA/BMP-2 支架，评估支架的表面特征、理化性质及其对骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）体外成骨分化能力的影响，探讨支架在组织工程骨领域应用的可行性，为临床新型人工骨修复骨缺损的研发提供可供选择的支架材料。

1 材料与方法

1.1 主要材料和仪器

BMP-2（上海瑞邦生物科技有限公司），生蚕丝（江苏如东新丝路有限公司），HA、无水LiBr、无水Na2CO3（上海阿拉丁试剂有限公司），透析袋、聚乙二醇（上海Biosharp 有限公司），碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色试剂盒（上海Yeasen有限公司）。DMEM细胞培养基、胎牛血清（Gibco 公司，美国），CCK-8 试剂盒（Dojindo 同仁化学公司，日本），成骨诱导培养基、BMSCs、茜素红染液、细胞荧光染液荧光素双醋酸脂（fluorescein diacetate，FDA）和 碘 化 吡 啶（propidium iodide，PI）均购自美国Sigma公司。

主要仪器包括水浴锅（常州国华电器有限公司），细胞培养箱（Thermo 公司，美国），临界点干燥仪（Leica 公司，德国），扫描电镜（scanning electron microscope，SEM，Hitach 公司，日本），水接触角测量仪（Data Physics 公司，德国），酶标仪器（Bio-Red公司，美国），共聚焦显微镜（Leica公司，德国）。

1.2 支架制备方法

1.2.1 SF 溶液制备 取适量生蚕丝置于0.02 mol/L Na2CO3中脱胶，烘干后放入9.3 mol/L LiBr 溶液中，搅拌至完全溶解，经透析、浓缩后得到质量浓度6%的SF溶液，将其置于4℃冰箱中保存备用。

1.2.2 SF/HA 混悬溶液制备 将2 g HA 粉末加入10 mL PBS（0.001 M，pH=6.8）溶液中，采用超声震荡法制备HA 混悬液，质量浓度为20%（W/V）。按照质量比（1∶4）将SF 溶液与HA 混悬液混合，超声震荡3 min，制成均匀的SF/HA混合溶液。

1.2.3 SF/HA/PDA/BMP-2 支架制备及分组 取100 μL 适量SF/HA 混合液加入模具中，迅速置于液氮中冷冻，冻干过夜，甲醇浸泡30 min，再次冻干后制得SF/HA 多孔支架。将SF/HA 支架置入PDA 溶液中（2 mg/mL，pH=8.5），慢速（50 r/min）震荡4 h，双蒸水洗3 次，制得SF/HA/PDA 支架。将制得的SF/HA/PDA 支架置入BMP-2 溶液中（2 mg/mL，pH=8.5），慢速（50 r/min）震荡4 h，双蒸水洗3 次，最后制得SF/HA/PDA/BMP-2 支架。将制备好的支架分为SF/HA 支架组、SF/HA/PDA支架组和SF/HA/PDA/BMP-2支架组，以用于后续实验。

1.3 SF/HA/PDA/BMP-2 支 架 上BMP-2 释 放 量 的检测

采用ELASA法检测SF/HA/PDA/BMP-2支架制成后1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d、28 d 的BMP-2累积释放量。

1.4 支架表征和理化性质

应用水接触角测量仪检测各组支架表面亲水性变化，应用SEM观察支架表面形态。

1.5 BMSCs增殖检测

分别在3 组支架上进行细胞培养。将各组支架裁剪合适后铺于96孔板底部，胎牛血清培养基浸泡过夜，PBS 清洗2 次，每个支架加入含有1 ×104个BMSCs 的细胞培养基200 μL，置入37°C、5% CO2培养箱培养，分别于1、4、7 d 加入20 μL CCK-8 试剂，培养2 h，取100 μL 溶液移入新的96孔板中，酶标仪检测450 nm吸光度。

细胞SEM 成像：细胞培养7 d，去除培养液，4%多聚甲醛固定1 h，乙醇梯度脱水，临界点干燥后喷金处理，SEM观察细胞形态。

细胞荧光染色：细胞培养7 d，取出上清液，PBS清洗2次，每孔分别加入100 μL FDA（5 μg/mL）和100 μL P（I5 μg/ mL），于37°C、5% CO2培养箱培养15 min，PBS清洗，在共聚焦显微镜下观察细胞形态。

1.6 BMSCs成骨分化能力检测

1.6.1 ALP活性检测 细胞与3组支架共培养，14 d去除培养基，PBS清洗2次，加入Triton X-100细胞裂解液，向细胞裂解液中加入ALP 染色试剂盒中的pNPP底物，在405 nm处检测吸光度值。

1.6.2 茜素红染色光镜观察 细胞与3 组支架共培养，方法同1.6.1。培养14 d 去除培养基，加入4%多聚甲醛固定15 min，PBS清洗2次，再加入2%茜素红染液，室温下染色20 min，去除染液，PBS 清洗2次，光镜下观察。

1.7 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，3组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 支架表面特征、理化性质比较

SF/HA 支架、SF/HA/PDA 支架、SF/HA/PDA/BMP-2 支架接触角分别为（54.7 ± 4.8）°、（43.7 ±3.7）°、（32.3 ± 2.4）°，差异有统计学意义（F=180.526，P=0.001），提示在PDA 涂层及接枝BMP-2 后，支架的亲水性逐渐增加（图1）。SEM图像可见SF/HA 支架表面相对光滑，SF/HA/PDA支架表面有颗粒物形成，SF/HA/PDA/BMP-2支架表面颗粒物明显增多，说明PDA 增加了支架表面的粗糙度，而接枝BMP-2后，支架表面的粗糙度进一步增加（图2）。

图1 水接触角测量仪检测3组支架亲水性1A SF/HA支架1B SF/HA/PDA支架1C SF/HA/PDA/BMP-2支架

图2 3 组支架扫描电镜成像2A，2B SF/HA 支架2C，2D SF/HA/PDA 支架2E，2F SF/HA/PDA/BMP-2支架

2.2 SF/HA/PDA/BMP-2支架BMP-2释放情况

ELASA 法检测结果显示支架上BMP-2 制备后在1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d、28 d 累计释放量分别为4.8%、9.2%、13.5%、18.4%、25.7%、31.6%、38.7%，呈缓慢持续释放趋势（图3）。

图3 ELASA 法检测SF/HA/PDA/BMP-2 支架上BMP-2 累积释放量

2.3 支架上BMSCs增殖和成骨能力检测结果比较

2.3.1 BMSCs 增殖能力 电镜和荧光染色结果显示，SF/HA 支架上细胞数量稀少，形态呈多角形；PDA涂层后细胞数量增多，细胞铺展良好；进一步接枝BMP-2 后细胞数量明显增多，局部呈片状生长，细胞黏附和生长能力更好（图4）。

图4 3组支架上细胞荧光染色及扫描电镜成像4A，4B SF/HA支架4C，4D SF/HA/PDA支架4E，4F SF/HA/PDA/BMP-2支架

CCK-8检测结果显示3组支架上BMSCs随时间推移均呈增殖趋势，其在SF/HA/PDA/BMP-2支架上的增殖能力优于SF/HA/PDA 支架和SF/HA支架，差异有统计学意义（F=21.637，P= 0.002，图5）。

图5 CCK-8法检测细胞在3组支架上的增殖能力

2.3.2 BMSCs 成骨能力 与细胞共培养2 周后，检测3 组支架上BMSCs 的ALP 活性，结果显示SF/HA 支架、SF/HA/PDA 支架、SF/HA/PDA/BMP-2支架ALP水平分别为（2.9±0.4）、（3.4±0.7）、（6.8±0.8）U/mg，差异有统计学意义（F=232.215，P=0.001）。茜素红染色结果显示SF/HA 支架呈浅色红染，SF/HA/PDA 支架呈红色染色，SF/HA/PDA/BMP-2支架呈深色红染（图6）。

图6 3组支架茜素红染色6A SF/HA支架6B SF/HA/PDA支架6C SF/HA/PDA/BMP-2支架（×10）

3 讨论

3.1 SF/HA多孔支架在骨修复领域的应用

近年来陆续有研究以SF和HA为原料制成具有良好孔隙率和一定力学强度的复合支架，结构上与天然骨组织相类似[6-7]。由于生物学相容性良好，力学性能优异，SF/HA多孔支架在骨组织工程领域有着较大的应用潜力。Kweon 等[8]将SF/HA作为假体涂层植入兔胫骨内，结果显示涂层后假体具有促进骨再生的作用。SF/HA支架还可作为药物载体，负载并缓慢释放BMP-2，体外研究证实其可促进BMSCs向成骨细胞分化，植入大鼠体内后能加速大鼠颅骨缺损区的修复[9]；SF/HA 支架还可通过负载BMSCs，促进兔桡骨缺损处的骨再生[10]。尽管目前基于SF/HA的骨组织工程支架材料尚处于基础研究阶段，但未来在骨科临床有着广阔的应用前景。

3.2 PDA涂层在SF/HA支架中的应用

单纯SF/HA 材料缺乏生物活性因子，导致其诱导成骨能力弱，在骨修复领域的应用受到限制。为提高其与生物活性因子的结合率，有学者通过PDA 涂层方法将生物活性因子接枝在高分子材料表面，明显提高了表面亲水性和粗糙度，生物学相容性得到改善[11]；体内外研究结果亦证实该方法能有效促进细胞黏附和增殖[12-13]，明显增强材料的成骨能力[14-15]。本研究结果表明，PDA涂层支架表面水接触角较单纯SF/HA 支架明显增加，颗粒物逐渐增多，PDA 涂层支架上细胞的黏附和增殖能力均优于单纯SF/HA 支架，与现有研究结果相似[16]。

3.3 SF/HA/PDA/BMP-2支架促进细胞增殖及成骨分化的作用

BMP-2 属于转化生长因子超家族成员，是一种疏水性酸性蛋白，具有强大的促成骨活性，能够诱导BMSCs向成骨细胞分化，在骨组织再生和修复领域应用广泛[17]。有研究者以SF/HA支架物理包裹BMP-2，体外实验结果显示该支架能够促进BMSCs向成骨细胞分化[18]。也有学者通过物理混合法制备壳聚糖/磷酸钙/BMP-2复合支架，结果表明支架能够促进兔胫骨缺损区的骨修复过程[19]。

尽管具有良好的骨再生作用，这些复合支架目前仍存在BMP-2 早期突释现象，难以满足骨骼再生过程中对BMP-2的持续需求[20]。本研究中采用PDA涂层方法接枝BMP-2，经过4周观察，支架上BMP-2 呈缓慢释放趋势，符合骨组织工程载药支架的需要。此外，本研究结果显示，SF/HA/PDA/BMP-2 支架上BMSCs 的黏附能力和增殖能力最佳，ALP活性及茜素红染色均优于其它两组，提示该支架上释放的BMP-2促进了细胞的黏附增殖和成骨分化。

相对于钛合金及天然高分子聚合物材料[21-22]，SF/HA多孔支架具有与天然骨组织类似的成分和结构，通过PDA涂层可进一步提高SF/HA支架的生物学相容性，有效接枝并缓释BMP-2 后可发挥其骨传导和骨诱导作用。总之，本研究构建的SF/HA/PDA/BMP-2多孔支架具有良好的生物学相容性和成骨活性，在骨组织工程领域有着广阔的应用前景。