陈皮人工接种黑曲霉加速陈化工艺可行性初探

钟俊杰，杨小燕，蓝锦阳，霍筠婷，李旭洪，肖新玉

(佛山市南海区人民医院 药剂科，广东 佛山 528200)

陈皮原名“橘柚”，始载于东汉《神农本草经》，列为上品，功效为“主胸中瘕热，逆气，利水谷，久服去臭，下气”[1]。传统认为橘皮以陈久者入药最佳，故现今沿用陈皮为名。本品为芸香科(Rutaceae)植物橘(CitrusreticulateBlanco) 及其栽培变种的干燥成熟果皮。其性温，味苦、辛，归脾、肺经，具有理气健脾、燥湿化痰之功效[2]。近现代学者对陈皮展开了系统深入的研究，越来越多的证据表明，陈皮在贮藏过程中由于物理变化、化学反应、微生物作用等使其药用活性成分含量增加，非药用活性物质减少，即“陈久者良”。陈皮是常用大宗药材，不但用量大，而且用途广，仅2015年版《中华人民共和国药典》一部中所收载的含陈皮的成方制剂就有100余种，古今专著收载的方剂含陈皮者更是数不胜数。近现代兴起的食疗保健热更使市场对陈皮的需求日益增长，尤其以陈年陈皮供不应求。目前市场上的陈皮贮藏年限一般从1～3年至十年、十几年甚至几十年不等，贮藏年份越久价格越高。民间向来有“一两陈皮一两金”的说法，虽然有夸张的成分，但也证明了陈年陈皮价格之高。现今陈皮陈化工艺大多是沿用传统的自然陈化工艺，在自然条件下陈化陈皮时间较长，且不可控因素太多，不利于大规模标准化生产。因此根据中医传统理论指导，结合现有陈皮陈化机理研究成果寻找高效且标准化的陈化工艺势在必行。本研究立足于陈皮陈化的相关研究成果，结合传统陈皮陈化工艺，初步探讨人工接种黑曲霉加速陈皮陈化的工艺，以期为深入研究陈皮加速陈化工艺提供参考。

1 陈皮之历史渊源

1.1 历史溯源

陈皮是我国传统常用中药材，其历史源远流长。本品最早以“橘柚”记载于东汉《神农本草经》，以果皮入药，故亦名“橘皮”，列为上品。虽然当时《神农本草经》并没有明确指出橘皮需陈用，但亦有“土地所处，真伪新陈，并有各法”的论述，提出药物有新、陈之别，为后来橘皮陈用提供了理论依据。南北朝时期，陶弘景[3]著《本草经集注》记载橘皮经过陈化之后使用效果更佳，指出“橘皮疗气大胜，以陈久者良”。雷敩[4]著《雷公炮炙论》记载：“其橘皮，年深者最妙。”经过长期的临床实践，这个时期的医家已经充分认识到橘皮需要陈化方能有更好的功效。唐代孟诜[5]著《食疗本草》中卷上橘篇中首次出现以陈皮称谓陈年橘皮，至此陈皮因其需陈化使用而渐渐独立成为一个新的中药材品种。元代王好古[6]著《汤液本草》记载“橘皮以色红日久者唯佳，故曰红皮、陈皮。去白者曰橘红也”，不但强调陈皮唯日久者佳，而且还将橘皮根据加工工艺不同分为了陈皮(红皮)与橘红。至明代，倪朱谟[7]著《本草汇言》记载：“沈则施曰：它药贵新，唯橘皮贵陈。”陈皮作为一个独立的中药材品种，陈化使之区别于其他药材，成为判断其质量好坏的一个重要标准。至此后世医家均沿用陈皮这一称谓到近现代。新中国成立后，从1953年版《中国药典》开始都是以陈皮作为正名一直沿用。

1.2 历代各家对“陈久者良”的论述

传统上认为陈皮“陈久者良”主要是去其燥性。唐代孙思邈[8]著《千金食治》中认为“入药以陈久橘皮辛辣气稍和为佳”，已经开始认识到久陈可以缓和橘皮辛辣之气，无耗气之虞。明代李中梓[9]在《雷公炮制药性解》中解析道：“陈皮辛苦之性，能泄肺部……采时性已极热，如人至老成，则酷性渐减，收藏又复陈久，则多历梅夏而烈气全消，温中而无燥热之患，行气而无峻削之虞。”清代汪昂[10]著《本草备要》也指出“陈则烈气消，无燥散之患”。由此可见古人认为陈皮陈化的主要作用是减少陈皮辛燥之气，避免由于峻烈之性而耗伤元气。

2 陈皮现代研究

2.1 陈皮的主要有效成分及药理作用

现代研究表明，黄酮类、挥发油类、生物碱类物质及微量元素是陈皮的主要有效成分。

2.1.1 黄酮类 陈皮含有多种黄酮类活性成分，主要以糖苷或苷元的形式存在，包括橙皮苷(hesperidin)、橙皮素(tangeretin)、新橙皮苷(neohesperidin)、川橙皮素(neobiletin)、二氢川陈皮素(citromitin)、5,6,7,8,4′-五甲氧基黄酮(5,6,7,8,4′-pentamethoxyflavone)等。

2.1.2 挥发油 陈皮含有大量挥发油成分，含量为1.9%～3.5%，包括右旋柠檬烯(d-limonene)、α-蒎烯(α-pinene)、β-月桂烯(β-myrcene)、α-水芹烯(α-phellandrene)、α-罗勒烯(α-ocimene)等。

2.1.3 其他成分 陈皮中还含有多种活性成分，其中有生物碱类对羟福林(syneprine，辛弗林)，多糖类陈皮多糖、果胶，微量元素钾、钠、钙、镁、铜、锌、铁、锶、锰等，还有肌醇、β-谷甾醇、麝香草酚等。

2.1.4 药理作用 大量研究表明陈皮提取物具有促进消化[11-12]、强心[13]、抗血栓[14]、抗氧化[15]、抗肿瘤[16]等多种药理作用。其中对羟福林(syneprine，辛弗林)现代药理研究比较明确，研究表明其对α受体，β受体皆有兴奋作用，可以增强心肌收缩力，增加心输出量，改变心脏泵血功能，在静脉给药途径下还能收缩血管，升高血压，具有抗休克作用[17]。此外，对羟福林可以刺激β-3肾上腺素受体而发生脂质分解及发挥生热作用，闫晗等[18]研究表明对羟福林对营养型肥胖大鼠有减肥效果，揭示了其具有减肥的药理作用。

2.2 陈皮“陈久者良”的现代科学阐释

目前“陈久者良”的现代研究大多着眼于不同贮藏年份黄酮类与挥发油成分含量变化上。

2.2.1 黄酮类 大多数研究结果显示陈皮储存时间越长，黄酮类成分含量越高。罗琼[19]研究表明陈皮的贮藏时间越长，橙皮苷的含量越高。林林等[20]比较不同年份新会陈皮总黄酮和橙皮苷含量，发现贮藏时间越长，总黄酮与橙皮苷含量越高。曹臣等[21]认为橙皮苷是一种黄酮类苷，由芸香糖与陈皮苷元结合组成，存放时间越长，陈皮内含的芸香糖与橙皮苷原形成的橙皮苷越多，因此含量随存放时间的增加而增加。张鑫等[22]研究发现无菌新鲜橘皮接种黑曲霉培养后可使其黄酮类总量增加，提示微生物在陈皮陈化过程中具有重要作用。也有研究表明，黄酮类活性成分不会随着贮藏时间的增加而一直增加。张鑫等[23]在模拟加速试验中发现总黄酮与橙皮苷的含量在实验过程中呈现先增后减的趋势，由此推论在实际陈化过程中黄酮类活性成分并非一直随时间增加而增加，提示陈化的时间并不一定是越久越好。

2.2.2 挥发油 大多数研究结果显示陈皮储存时间越长，总挥发油成分含量越低。罗琼[19]研究表明随着陈皮贮藏时间的增加，挥发类成分含量逐渐降低。易仑朝等[24]通过研究新鲜及陈旧陈皮样品中挥发性成分发现，各低沸点成分，如柠檬烯等随着贮藏时间的增加，含量均有所下降，而高沸点成分含量下降缓慢。现代药理学研究表明，陈皮的“辛辣之气”主要是挥发性物质的作用，而经过长期贮藏，其所含的挥发油自然挥发，含量下降，起到了“烈气消”的作用。易仑朝等[24]认为正是由于柠檬烯等成分逐渐减少，陈皮气味随之香醇。此外，张鑫等[22]研究发现无菌新鲜橘皮接种黑曲霉培养后可以使其挥发油总含量降低，而挥发油的种类增加，提示微生物在陈皮陈化过程中具有重要作用。

2.2.3 陈皮陈化过程中的微生物作用 刘素娟等[25]首先从陈年陈皮分离得到真菌并证明其在陈化过程中对陈皮药效物质产生影响。后续研究中首次将从陈皮中分离得到的黑曲霉返接种到无菌陈皮样品中，在恒温恒湿培养后测定发现，陈皮总黄酮含量增加，挥发油含量降低，但发挥油的种类增加[22]。该研究揭示了黑曲霉与陈皮陈化作用的相关性，证实了陈化过程中微生物的作用，为“陈久者良”研究提供了新思路。

3 黑曲霉菌概述及相关应用

3.1 黑曲霉菌概述

黑曲霉(Aspergillus niger)是一种常见的真菌，属于半知菌亚门，丝孢子纲，丝孢子目，丛梗孢科，曲霉属，广泛存在于自然界中。黑曲霉具有生长旺盛、发酵周期短、不易产生毒素等特点，是美国食品药品监督管理局(FDA)认证的安全菌种[26-27]。

3.2 黑曲霉的现代应用

黑曲霉是现代工业的重要发酵微生物，其可以生产淀粉酶、酸性蛋白霉、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶等多种酶制剂，因而在工业酶制剂、有机酸发酵、生物发酵等方面应用广泛。自上世纪90年代以来，分子生物学的进步率先揭开了全面研究黑曲霉细胞工厂运作机制的序幕，2007年黑曲霉基因组的公布更是将黑曲霉的研究引入后基因组时代，其基因组数据的公布为功能基因组学的深入研究奠定了基础，转录组、蛋白组、代谢组方面的数据很快得到了发表，使细胞工厂设计和代谢工程研究变得更加便捷，也为通过工程手段提高工业生产菌株性能提供了新的思路和方法[28]。

4 传统陈皮产地加工与陈化工艺简介

笔者曾赴广陈皮核心产区新会天马产区实地考察，通过走访当地陈皮种植户与陈皮加工作坊初步了解了陈皮的产地加工方法及传统陈化工艺。

广陈皮一般从立秋开始采收，分为立秋至秋分、秋分至立冬、立冬至冬至三个时期。果实的成熟程度不同产生了新鲜橘皮外观颜色上的差异，传统上形象地分别称之为“青皮、二红皮、大红皮”。当地传统上认为三者制成陈皮的功效是有所差别的，青皮味较辛涩，一般药用为主；大红皮味道较醇厚但陈化条件要求苛刻，价格较高，一般作为茶饮或者高级食材调料；二红皮则介于两者之间，使用范围最广。

采收后的鲜果首先进行分级，然后采用“对称二刀法”或“正三刀”法剥皮，得到三瓣的果皮。选择晴朗的天气，将其置于阳光下使鲜皮自然失水萎蔫质地变软后翻皮，使橘白向外。新会当地家庭最传统的做法是将经过自然生晒至完全干燥的果皮穿成一串吊在房前屋后或者灶台上方自然陈化，随用随拿，并无特意加工。而现今作坊普遍是用黄麻袋装好进入专门的陈化仓库进行陈化。陈化仓库环境要求通风、干爽，用袋装好的陈皮要离墙、离地、离顶，环境温度常温即可。

陈皮陈化前5年都要适时翻晒，待5年之后状态基本稳定后可用罐子密封保存，通常2～3年就可以上市售卖，但由于温度、湿度、微生物条件等不可控条件较多，各批次的陈皮质量往往难以一致，加之陈化耗时较长，占用地方较多，成为了目前制约陈皮产业发展的主要因素。

5 加速陈化工艺的设想及可行性分析

5.1 陈皮加速陈化工艺的设想

5.1.1 黑曲霉菌株的筛选 优良的菌株是陈皮陈化过程中药效活性成分转化的关键。分别在5年、10年、20年陈皮上分离黑曲霉菌菌株，通过实验筛选具有明显促进陈皮药效物质转化作用且培养条件合适的菌株，筛选出的菌株进行大规模培养，生产大量优良黑曲霉菌株孢子，供陈皮接种使用。

5.1.2 黑曲霉接种 使用辐射灭菌法对完全干燥好的新鲜橘皮(新会茶枝柑)进行灭菌。灭菌后喷洒黑曲霉孢子悬浮液，用黄麻袋装好后置于加速陈化仓库中进行陈化。

5.1.3 建立加速陈化仓库 加速陈化仓库采用非层流型空气系统取代自然通风，引入恒温恒湿设备使陈化过程中仓库温度保持在30 ℃，湿度保持在75%，使陈皮在恒定的温湿度下进行55天的加速陈化。

5.1.4 陈皮粉发酵陈化工艺 取完全干燥的新鲜橘皮制成粗粉，进行辐射灭菌后加入黑曲霉孢子悬浮液，充分混合后放入30 cm×30 cm×10 cm的小型黄麻袋中，稍稍压紧后在温度30 ℃，湿度90%的条件下发酵陈化20天。

5.2 可行性分析

5.2.1 陈化环境优化 陈皮陈化过程中药效物质的转化与陈化环境温度、湿度和微生物息息相关。传统上陈皮陈化是在自然通风环境下进行，温度与湿度受天气的影响较大，难以长期保持陈化的最佳温湿度而导致耗时延长，加之微生物等条件也难以控制，共同造成了不同批次陈化的陈皮质量难以一致，难以达到现代医疗的质量要求。针对这个问题，新工艺优化了陈化仓库的通风系统，采用非层流空气系统取代了自然通风，这样不仅使仓库内部环境不会直接受外界天气影响，还能一定程度减少外界微生物进入，为陈化过程中的陈皮提供一个相对稳定且较为洁净的环境。采用恒温恒湿系统则使陈化过程的温度与湿度保持在合适范围。仓库内不受外界温度、湿度等影响，每一批次的陈皮陈化过程中酶促反应与微生物作用都是在最优化的条件下进行，与传统工艺相比可使陈化效率更高、耗时更短。张鑫等[23]研究表明在模拟加速陈化实验中，广陈皮(茶枝柑)的各药效成分转化最佳天数为55天左右。

5.2.2 微生物条件优化 成都中医药大学的团队已经证实了陈皮陈化过程中黑曲霉的重要作用。新工艺通过筛选优良的黑曲霉菌株，再人工接种到经过消毒的新鲜橘皮(茶枝柑)上，这样不仅可以避免陈化过程中多种微生物共同作用带来的质量不可控问题，还能一定程度上加快药效成分的转化效率而使陈化耗时缩短。

5.2.3 陈皮(打粉)陈化新思路分析 陈皮是常用大宗药材，其作为原料大量应用于中成药中，因此制药产业的需求量尤为巨大。制药企业应用陈皮大多采用粉碎后提取有效成分或直接打粉混合制成胶囊使用，对饮片的外观要求不高。新工艺设计采用橘皮粗粉接种黑曲霉进行加速发酵陈化，经过粉碎后的橘皮会有更大的表面积，各种酶促反应可以更充分地进行。粉碎后的橘皮在人工接种黑曲霉孢子时可更好地混合，使其作用效率更高。新工艺在整片陈皮陈化的基础上制成粗粉发酵陈化，更能缩短陈化时间，提高陈皮生产效率，满足制药工业的巨大需求。

6 讨论

陈皮作为传统中药材应用已有两千余年历史，无论是历代本草文献还是现代研究均支持“陈久者良”的观点。然而陈化多长时间才算久陈？什么样的质量标准才能判断为良？上述问题一直没有明确答案。药效活性成分含量是评价中药饮片质量的重要依据，2015年版《中国药典》(一部)中陈皮项下只有橙皮苷的含量标准，显然单一测定橙皮苷含量不能全面评价陈皮的质量优劣。传统认为陈年陈皮气味更加醇厚，但从气味等方面判断质量未免过于主观，难以得到直观反映质量水平的量化数据。因此，笔者认为制定合理的陈皮质量评价标准势在必行。通过现代中药指纹图谱技术，结合现代药理学研究制定出科学全面的陈皮质量评价标准，在此标准下进行“陈久者良”研究与陈化工艺改进，才可以为陈皮陈化研究奠定坚实的基础。

本研究通过查阅资料对黑曲霉加速陈化陈皮工艺进行了前期设计，但这仅仅是一个前期设想，很多具体方面都需要漫长的探索与复杂的研究过程。例如良种黑曲霉的筛选就是一个庞大的系统工程，甚至在改良黑曲霉的过程中还要引入基因工程技术对黑曲霉进行分子生物学改造；陈化仓库的温度湿度条件设置也需要通过大量的实验进行摸索；加速陈化工艺中陈皮原植物的选择、采收时间与干燥程度等也都需要通过大量的实验进行探索。综上所述，本设计虽仍有诸多问题尚未明确，但仍以期为陈化陈化工艺的研究提供一定参考。