栀子中环烯醚萜苷类成分的分析方法及药动学研究进展

何旭辉，闻 俊,2*，周婷婷,2

[1.海军军医大学药学院药物分析学教研室，上海 200433; 2.上海市药物(中药)代谢产物研究重点实验室，上海 200433]

中药栀子为茜草科植物栀子GardeniajasminoidesEllis.的干燥成熟果实，味苦、寒，归心、肺、三焦经，具有泻火除烦、清热利湿、凉血解毒的功效，主要用于热病心烦、湿热黄疸、淋证涩痛、血热吐衄、目赤肿痛、火毒疮疡等症[1]。栀子中主要的活性成分为环烯醚萜苷类(iridoid glycosides,IGs)，具有抗炎、解热、利胆和轻泻等药理作用，临床应用广泛。目前已从栀子中分离得到IGs成分50多种，其中京尼平苷(也称栀子苷)、西红花苷和黄酮等成分含量较高[2]。作为药食两用的中药材，栀子的临床应用安全性日益受到关注。京尼平苷是栀子中IGs成分的代表，可以提高谷胱甘肽转移酶的活性，增加肝脏中谷胱甘肽的含量，具有肝保护作用；但同时京尼平苷的摄入量过大或时间过长，也会导致肝损伤[3,4]。因此，建立对京尼平苷为代表的IGs成分的分析方法，有助于对栀子及其中药复方中IGs成分含量进行准确测定；同时为含有栀子的中药复方药动学研究及探索IGs成分的体内处置提供依据，对含有栀子的中药复方的临床合理用药和安全性评价均具有重要意义。

1 IGs成分的定量分析方法

栀子中IGs成分较多，结构相近，可以采用紫外光谱法对其总含量进行测定。周婷婷等[5]以京尼平苷作为对照品，以30%甲醇为溶剂，在238 nm处测定吸光度，结果显示栀子提取物中总IG以京尼平苷计达56.50%。该方法对于以总IG含量为指标，进行含栀子中药复方的活性成分的提取及纯化工艺的考察具有重要意义。Han等[6]用HPLC-DAD-ESI-MS法对17个产地的栀子药材中9个IGs成分进行了含量测定，发现京尼平苷、京尼平苷酸、去乙酰车前草酸甲酯等IGs成分对药材质量的影响较大。刘聪等[7]采用超高效液相色谱法(UPLC)对44批栀子药材进行指纹图谱分析，发现湖北、江西、湖南所产的栀子质量较好，不同产地栀子中京尼平苷和西红花苷的含量有明显差异。何国振等[8]采用HPLC法对不同成熟期的栀子果实进行定量分析，发现在栀子果实成熟过程中京尼平苷含量先下降再上升最后下降，最高可达约6%，表明不同采收期的栀子中IGs成分含量具有明显差异。全青期为京尼平苷和西红花苷-1的最佳采收期，根据果实颜色及时采收才能获得高含量的目标活性成分。沈晨等[9]采用UPLC法对生栀子和焦栀子中的京尼平苷进行含量测定，结果显示，炒焦过程影响京尼平苷的稳定性，焦栀子中京尼平苷含量较生栀子低。 由此可见， 不同采收期、不同产地以及炮制过程均会使栀子中IGs成分的含量发生改变， 从而可能影响到临床用药的安全性和有效性。 因此在质量控制环节， 多成分定量结合指纹图谱分析的策略， 可以对栀子或含有该药材的中药制剂进行全面、有效的质量评价。

1.1 HPLC法 IGs成分具有较大的极性，采用HPLC法对其进行分离、分析，主要采用反相C18色谱柱，流动相中有机溶剂占比普遍较低，以延长待测成分的保留时间；水相中均加入一定量的酸性改性剂，以改善分离效果。由于IGs成分复杂，含量差异较大，因此以紫外光检测时，一般检测其中含量最高的京尼平苷。最近发表的文献中对栀子中IGs成分具有代表性的HPLC分析条件见表1。

1.2 LC-MS法 液相色谱质谱联用技术(LC-MS)将色谱的高效能分离与质谱的高灵敏度、强专属性检测结合起来，通过对化学成分色谱峰的保留时间、一级和二级质谱图的鉴定，并与已知对照品数据进行比较，从而实现对多种化学成分的同时定性鉴别[6,14]，主要用于生物样品中IGs成分测定。IGs成分在正离子模式下除了产生准分子离子峰[M+H+]之外，还可能产生[M+Na+]峰、[M+NH4+]峰；在负离子模式下，会产生[M+HCOO-]峰或[M+CH3COO-]峰，在定量过程中需要根据流动相添加剂分辨最佳母离子。IGs成分中的同分异构体，如羟异京尼平苷、鸡屎藤次苷甲酯和去乙酰车前草酸甲酯，具有相同的裂解规律[15]，因此无论采用何种模式检测，都需要对上述成分实现基线分离[16,17]。

IGs成分具有较好的水溶性，主要采用蛋白沉淀法和固相萃取法对血浆样品进行前处理。Qu等[16]用乙腈作为蛋白质沉淀剂，提取大鼠血浆中6种IGs成分，蛋白质沉淀过程中加入0.1%甲酸，可以有效破坏IGs成分与蛋白质的结合，获得较高的提取回收率。Zeng等[18]采用含10 mg/ml维生素C的甲醇沉淀蛋白质，然后加入无水硫酸镁去除过多水份，再加入C18填料吸附脂溶性干扰物质，可以提高京尼平苷和京尼平苷酸的萃取效率，降低基质效应，该法被称为单管多杂质沉淀萃取(single-tube multi-impurity precipitation extraction，SMIPE)。Zheng等[19]采用不同固相萃取填料对血浆中京尼平苷酸进行萃取，发现弱阳离子交换柱可以达到80%的提取回收率，而C2、C8和C18固相萃取填料的提取回收率非常低。对于尿液样品，Chen等[20]采用甲醇稀释，离心取上清液挥干；对于匀浆后的组织样品，采用甲醇沉淀蛋白质，再将上清液取出挥干；上述提取残渣用乙腈-水-甲酸(50∶50∶0.1)复溶后，用LC-MS法分析，生物样品中的京尼平苷及其代谢产物京尼平的最低定量限可低至0.5 ng/ml。近年来发表的文献中定性鉴别和定量测定IGs成分的具有代表性的LC-MS法分析条件见表2。

SIM：选择离子监测；MRM：多反应监测；SRM：选择反应监测

2 栀子中IGs成分的药动学研究进展

栀子化学成分复杂，单用或与其他中药配伍使用，在剂量上没有统一标准，因此进入体内后，IGs成分的处置也会有所不同。目前，IGs成分的药动学研究主要以口服给药方式为主，研究药物有京尼平苷、京尼平苷酸等单体，栀子提取物，以及栀子大黄汤、栀子豉汤、醒脑静口服液等复方制剂。

2.1 吸收 Wang等[28]研究发现，大鼠灌胃给予京尼平苷100 mg/kg后，达峰时间(tmax)为(0.50±0.03) h，峰浓度(cmax)为(1.40±0.24) μg/ml，消除半衰期(t1/2)为(3.55±0.69) h，AUC为(6.76±1.23) μg·h·ml-1，表明京尼平苷口服吸收较快，与静脉注射给药10 mg/kg相比，口服给药的绝对生物利用度约为9.67%。Cheng等[29]研究大鼠灌胃给予京尼平苷、栀子提取物和栀子豉汤提取物(以京尼平苷计200 mg/kg)，发现京尼平苷的tmax约为30 min，cmax分别为(0.26±0.10)、(1.02±0.60)、(0.97±0.30) μg/ml，AUC分别为(32.07±15.63)、(245.05±85.13)、(205.93±40.41) μg·min·ml-1，其绝对生物利用度分别为4.23%、32.32%和 27.17%。单体化合物京尼平苷给药后在体内消除较快，暴露程度较低，而栀子提取物和栀子豉汤复方制剂给药后，京尼平苷的体内血药浓度较高，说明中药提取物或复方制剂给药后会增加京尼平苷的吸收，这种吸收可能与同时给药的化学成分抑制了P-糖蛋白从而减少了京尼平苷的外排有关[30]。研究还发现，栀子豉汤给药后京尼平苷的AUC略小于栀子提取物，这可能是由于淡豆豉中的异黄酮抑制了IGs成分的吸收。同样，栀子豉汤给药后，体内京尼平苷酸的AUC也略小于栀子药材给药[31]。在胆汁淤积肝损伤模型大鼠体内还发现，大鼠灌胃栀子大黄汤后，体内京尼平苷和京尼平龙胆双糖苷的cmax、AUC和t1/2均显著大于正常大鼠相应的参数，这可能与胆汁淤积造成肝损伤，引起肝药酶活性下降有关，使得IGs在体内作用时间更长，治疗作用增强[24]。

2.2 分布 吴欢等[32]给大鼠灌胃60 mg/kg京尼平苷，检测各组织中药物浓度，发现肾脏最高，其他依次为肝、脾和脑。Wang等[28]给大鼠灌胃京尼平苷100 mg/kg，各组织AUC测定结果显示：肾>脾>肝>心>肺>大脑，表明京尼平苷在肾脏中分布较多，这与其具有较大水溶性，易于从尿液中以原形排泄有关。将京尼平苷制成固体脂质体纳米制剂后，以100 mg/kg剂量灌胃大鼠，不仅其t1/2显著延长至约35 h，各主要组织中的浓度也显著增加，尤其是在心、脑、肝中的组织分布，这将有助于提高药物在这些靶器官的治疗效果[33]。Qu等[17]采用脑部微透析取样技术测定了大鼠给予栀子豉汤后5种IGs成分在脑组织中的分布，各成分均在5.8～7.4 h达到最高组织浓度，t1/2为0.8～2.1 h，说明上述成分向脑分布较慢，且消除较快。各成分在海马和下丘脑的组织浓度高于在大脑皮层、纹状体、延髓和小脑的浓度，提示IGs成分入脑后主要累积在神经递质受体丰富的海马部分，起到抗抑郁的作用。Xu等[34]研究发现，冰片与栀子药对提高了京尼平苷的血药浓度，冰片-栀子药对可有效提高脑组织中京尼平苷的浓度[35]，鼻腔给予该药对后，脑组织中京尼平苷相对于静脉给药的生物利用度可达86.97%。体外实验表明，冰片可以结合到细胞膜表面，改善细胞膜的通透性，增加细胞膜磷脂分子链的有序排列，当透过物质为水溶性物质时，冰片可以打开细胞间连接，减少物质与磷脂分子的碰撞，提高药物通过细胞连接的速率[36]。所以脑中风大鼠模型灌胃给予醒脑静(含栀子、冰片、麝香、郁金)液体制剂后，脑组织中可以检测到京尼平苷、京尼平龙胆双糖苷和京尼平苷酸，且具有较高的组织浓度[26]。

2.3 代谢 栀子及其复方制剂以口服给药为主，京尼平苷在胃液中较稳定，进入肠道后受肠道菌群作用脱去糖基生成京尼平；羟异京尼平苷则在胃液中发生异构化，生成鸡屎藤次苷甲酯和去乙酰车前草酸甲酯，然后在肠道内进一步生成脱糖基代谢产物[37]。京尼平龙胆双糖苷同样在肠道内脱去一分子糖生成京尼平苷，并进一步生成京尼平[38]。可见，栀子中的IGs成分首先经胃肠道发生代谢，主要为脱糖基代谢，生成相应苷元，如京尼平或京尼平酸；之后京尼平还可以在肠道内发生N-杂环化反应，由氮取代2位的氧，生成京尼平碱[39]。吸收入血的苷及苷元会在肝脏中发生广泛的Ⅱ相结合反应，生成葡萄糖醛酸结合物、硫酸结合物，有的苷元会再次结合葡萄糖，转化成苷，通过胆汁分泌到肠道，形成肠肝循环。除了结合反应外，IGs母核还会在肝脏中发生去羟基、开环及还原反应，生成相应的代谢产物[40,41]。

急性毒性实验显示，大鼠灌胃861 mg/kg京尼平苷后，24～48 h开始出现肝脏毒性；细胞毒性实验则显示，肠道代谢产物京尼平的毒性远大于京尼平苷。京尼平具有明显的肝细胞毒性作用，是栀子致肝毒性的直接物质基础，氧化应激导致的线粒体损伤与细胞凋亡是京尼平引起肝毒性的主要作用机制之一[42,43]。由此可见，含有栀子的复方制剂给药后，其剂量大小及共同成分均对肠道菌群有影响，可能改变肠道中IGs成分转化为苷元的过程。因此，今后需要对复方制剂给药后的肠道代谢进行研究，探讨IGs成分的体内代谢途径，为临床安全、合理用药提供必要的基础。

2.4 排泄 大鼠静滴热毒宁注射液后24 h内，京尼平苷、京尼平龙胆双糖苷、断氧化马钱子苷、獐牙菜苷和山栀苷的尿液累积排泄量达70%以上；而断马钱子酸仅为7%，这可能与该成分主要在肝脏中发生氢化代谢有关；同时京尼平苷酸在尿液中被大量检测到，这是由于京尼平苷在肝脏中发生去甲基化反应生成京尼平苷酸后随尿液排泄。胆汁排泄的结果与尿液排泄相符，京尼平苷酸排泄率最高，而断马钱子酸排泄率最低[21]。

栀子中IGs成分的研究，对于探讨栀子的药效物质基础、药理作用机制及毒性具有重要作用。目前针对栀子及其复方制剂的研究，主要形成了化学指纹图谱结合指标性化学成分定量的评价手段，以确保栀子及其复方制剂质量的安全、可靠。针对栀子IGs成分的体内代谢过程研究，已经从单一的京尼平苷扩大到其他IGs成分，研究栀子提取物以及不同复方制剂给药后，体内IGs成分的吸收、分布、代谢、排泄，并结合病理模型研究IGs在肝损伤、脑卒中、糖尿病等大鼠模型体内的处置过程。但是针对栀子复方制剂的配伍规律等研究，仍然需要不断改进分析检测手段，在上述研究的基础上，重点深入研究靶器官和靶组织中IGs成分的浓度，结合其药效和毒性，实现多靶点、多组分、多效应的药效物质基础研究，为栀子及其复方制剂的临床应用及中药新药开发奠定基础。