母源毒死蜱暴露对子代小鼠海马COX2、CREB 和BDNF mRNA 及蛋白表达的影响

张群峰 何浣滢 廖云豪 王国卿

东北大学 生命科学与健康学院，沈阳，110819，中国

母源毒死蜱（chlorpyrifos，CPF）具有低毒、低残留等特点，是当前农业生产中用量最大、用处最广的有机磷农药之一。CPF 进入机体后，会通过血液循环在一些脂溶性组织、器官内蓄积。成年SD 大鼠经皮下注射CPF 后，在其肝脏中能够检出CPF［1］。此外，在肾脏［2］、脾脏［3］等组织中也有CPF 蓄积。但是关于母源CPF 连续暴露在子代体内的检测还未见报道。研究发现，对出生后大鼠幼年期及成年期分别进行CPF 暴露，都会引起其认知行为发生改变，并且伴随着神经化学变化［4］。有关CPF 产生神经毒性作用过去主要集中在其抑制乙酰胆碱酯酶的活性方面［5］。随着研究的深入，炎症反应在神经毒性方面的作用越来越受到重视［6］。本研究通过对母代小鼠进行CPF 染毒，对母代和子代小鼠血液中CPF 进行测定，来探讨CPF 能否通过母源暴露传递到子代，通过检测引起炎症反应通路环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX2）-环磷腺苷效应元件结合蛋白（cyclic adenosine monophosphate response element-binding protein，CREB）-脑源性 神经营 养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）基因和蛋白的变化，来探讨母源暴露CPF 对子代小鼠产生神经毒性作用的机理。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级CD-1 小鼠，50 只，♀ ♂各半，6 周龄，购于北京维通利华实验动物技术有限公司［SCXK（京）2016-0011］。

1.2 实验试剂

CPF，购自Sigma 公司；橄榄油，购自天津甘蒂国际贸易有限公司；SPE 萃取小柱，购自Agilent Technologies公 司；固 相RNase 清除剂，购自Solarbio 公司；Eastep®Super 总RNA 提取试剂盒、GoScriptTMReverse Transcription System、A6001 GoTaq® qPCR Master Mix，均购自普洛麦格（北京）生物技术有限公司；β-Actin（13E5）Rabbit mAb、CREB（48H2）Rabbit mAb，均购自Cell Signaling TECHNOLOGY 公司；Rabbit AntiproBDNF polyclonal antibody，购自MILLIPORE 公司；COX2 antibody，购自abcam 公司；辣根酶标记山羊抗兔IgG（H+L），购自北京中杉金桥生物技术有限公司等。

1.3 实验方法

小鼠饲养7 d 以适应环境，然后25 只雌性小鼠随机分为对照组（control 组：不做任何处理）；溶剂组（cpf0组：用橄榄油进行灌胃）；给药组（cpf0.3组：用含0.3 mg·mL-1CPF 的橄榄油进行灌胃；cpf0.6组：用含0.6 mg·mL-1CPF 的橄榄油进行灌胃；cpf1.2组：用含1.2 mg·mL-1CPF 的橄榄油进行灌胃），每组5 只雌性小鼠按照各自组别进行妊娠前处理2 周，之后按照雌雄1∶1 比例合笼进行交配，次日检查阴栓情况，母鼠妊娠后按照各自组别进行妊娠后处理6 周，至仔鼠断奶，溶剂组和给药组母鼠每日给药剂量10 mL·kg-1，待末次给药结束24 h 后，采集母鼠血液，每窝仔鼠采集血液后处死，采集海马组织。

血液离心分离血清，精密量取血清200 μL，加到预处理后的SPE 萃取小柱上，收集洗脱液，氮气吹干，乙腈复溶。色谱条件：①色谱柱：岛津WondaSil C18-WR 5 μm，4.6 mm×150 mm；②流动相：乙腈-水（90∶10）；③流速：1.0 mL·min-1；④柱温：30℃；⑤检测波长：229 nm；⑥进样体积：20 μL。按上述色谱条件，制备CPF标准曲线，计算CPF 浓度。

海马解冻后，一半用于荧光定量PCR 反应，引物序列，见Tab.1。按照说明书操作提取总RNA 反转录为cDNA，进行荧光定量PCR 反应，反应条件为：预变性：95℃ 30 s→（变 性：95℃ 5 s→退 火：60℃ 30 s→延伸：72℃ 30 s）×40 个循环（采集荧光）→溶解曲线阶段：95℃ 15 s→60℃ 1 min→95℃ 15 s。另一半用于Western blot 实验，其中β-actin 及CREB 一抗稀释比例均为1∶1 000，COX2 抗体稀释比例为1∶700，BDNF 抗体稀释比例为1∶3 000。二抗稀释比例为1∶10 000。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计分析软件对数据进行统计分析，实验数据表以均值±标准差（）表示，多组样品间比较采用单因素方差分析，P＜0.05 表示有显著性差异，P＜0.01 表示有极显著性差异。

2 结果

2.1 母代和子代小鼠血浆中CPF 的浓度

母代和子代小鼠血浆中CPF 浓度，在control 组和cpf0组均未检出，在实验组母代和子代小鼠血浆中均检测出CPF，且组间存在剂量关系，随着母代给药剂量的增加，母代和子代各组小鼠血浆中CPF 含量均有显著升高，结果见Tab.2。

Tab.2 CPF concentration in plasma of maternal（n=5）and offspring（n=8）mice（）

Tab.2 CPF concentration in plasma of maternal（n=5）and offspring（n=8）mice（）

Note：Comparison between the same column in the table.The letter of“a，b，c，d”is the superscripe of the expermental data.There is no significant difference between the groups with the same letter（P＞0.05），and there is significant difference between the groups without the same letter（P＜0.01）.

2.2 子代小鼠海马组织中COX2、CREB 及BDNF mRNA 的表达

母源CPF 暴露后，子代小鼠海马组织COX2 mRNA 的相对 表达量，与control 组相比，cpf0.6组（P＜0.05）与cpf1.2组（P＜0.01）COX2 mRNA 的表达均升高；与cpf0组相比，仅cpf1.2组COX2 mRNA 的表达升高（P＜0.05）；给药组组间相比，cpf1.2组的COX2 mRNA 的表达明显高于cpf0.3组和cpf0.6组（P＜0.05）。子代小鼠海马组织CREB mRNA 的相对表达量，与control 组相比，cpf0.3组（P＜0.05）、cpf0.6组（P＜0.01）与cpf1.2组（P＜0.01）CREB mRNA 的表达均显著降低；与cpf0组相比，cpf0.6组（P＜0.05）与cpf1.2组（P＜0.01）CREB mRNA 的表达呈明显降低趋势；给药组组间相比，cpf0.6组CREB mRNA 的表达与cpf0.3组和cpf1.2组相比，均有显著性差异（P＜0.05）。子代小鼠海马组织BDNF mRNA的相对表达量，与control 组和cpf0组相比，cpf0.3组和cpf0.6组的BDNF mRNA 的表达降低均较显著（P＜0.05）；与control 组和cpf0组相比，cpf1.2组的BDNF mRNA 的表达的降低极显著性差异（P＜0.01），且cpf1.2组的BDNF mRNA 表达明显低于cpf0.3组（P＜0.05），结果见Fig.1。

2.3 子代小鼠海马组织中COX2、CREB 及BDNF 蛋白的表达

母源CPF 暴露后，子代小鼠海马组织中COX2 蛋白相对表达量，与control 组和cpf0组相比，各给药组COX2 蛋白表达量均显著升高（P＜0.01），给药组间相比，cpf0.6组COX2 蛋白表达量显著高于cpf0.3组（P＜0.01），cpf1.2组COX2 蛋白表达量显著高于cpf0.3组与cpf0.6组（P＜0.01）。子代小鼠海马组织中CREB 蛋白相对表达量，与control 组和cpf0组相比，随着给药剂量升高而显著降低（P＜0.01），cpf1.2组与其他两个给药组相比蛋白表达量均显著降低（P＜0.01），cpf0.6组CREB 蛋白表达量显著低于cpf0.3组（P＜0.05）。子代小鼠海马组织中BDNF 蛋白相对表达量，与control 组和cpf0相比，cpf0.6组和cpf1.2组BDNF 蛋白表达量显著降低（P＜0.05或P＜0.01），给药组间相比，BDNF 蛋白的表达量显著降低（P＜0.01），结果见Fig.2。

3 讨论

CPF 进入机体后，能够在机体内蓄积和代谢。Fenske［7］等对野外工作人员的CPF 暴露情况进行了研究，结果在其尿液中检测出含有CPF 的代谢产物3，5，6-三 氯-2-吡啶酚（3，5，6-trichloro-2-pyridylphenol，TCP），若长期接触下去，必定会影响机体的健康，导致出现某些健康风险。CPF 可通过抑制乙酰胆碱酯酶的活性造成神经系统产生毒性作用，这主要是在CPF 的作用下，体内的乙酰胆碱酯酶发生磷酸化，因此乙酰胆碱不能再被其水解，最终引起神经系统中乙酰胆碱的积累，使神经系统产生毒性作用。然而，在没有乙酰胆碱酯酶抑制作用的情况下，动物体仍能表现出神经行为异常现象［8］。

COX2 信号通路介导的炎症反应，在神经系统疾病反应中发挥重要作用。研究发现，经过长期抗抑郁治疗后能够加强环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）下游通路水平，增强蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）酶活性，使CREB 基因表达升高［9］。BDNF 在维持神经细胞功能方面有重要作用，研究通过上调BDNF 的表达水平能够提高小鼠的认知功能［10］，长期给予BDNF能够使动物产生抗抑郁样状态［11］，并且长期进行抗抑郁治疗也能够增加神经系统的BDNF 水平［12］。CREB与BDNF 表达的增加出现在同一细胞层，并且时间相近，注入抗CREB 抗体还能够降低BDNF 表达水平，提示CREB 也能够调节BDNF 的表达［13］。

Fig.1 Expression of COX2、CREB and BDNF mRNA in hippocampus cortex of offspring in different groups（n=8）

Fig.2 Expression of COX2、CREB and BDNF protein in hippocampus cortex of offspring in different groups（n=8）

Fig.2 （continued）

COX2 是介导一系列炎症反应发生的关键酶。在炎症细胞因子和丝裂原的刺激下，COX2 能催化花生四烯酸（arachidonic acid，AA）生成相应的前列腺素（prostaglandin，PGs），这些前列腺素主要是PGE2，通过相应的G 蛋白偶联受体发挥不同的生物学效应，进而引起炎症和组织损伤。PGE2通过与不同的PGE2受体结合，调节cAMP 的生成，使cAMP 通路下游部分CREB和BDNF 表达降低［14］。本实验中，通过对母代小鼠进行CPF 灌胃处理至仔鼠断奶，采集样本，应用荧光定量PCR 及Western blot 检测发现，COX2 基因与蛋白表达增加的同时，CREB 与BDNF 表达均是降低的，表明CPF 能够通过母源暴露作用于子代，进而作用于COX2-CREB-BDNF 信号通路，产生级联反应，引起代谢通路发生改变，使神经兴奋性降低，从而产生神经毒性作用。