诱发肺结核动物模型方法及评价

张丹参 张健美

河北科技大学，石家庄，050018，中国

结核病是由结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的慢性传染病，可侵及许多脏器，以肺部结核感染最为常见。排菌者为其重要的传染源。人体感染结核菌后不一定发病，当抵抗力降低或细胞介导的变态反应增高时，才可能引起临床发病。若能及时诊断，并予合理治疗，大多可获临床痊愈。

1 诱导肺结核动物模型的方法

1.1 方法概述

诱导肺结核的方法主要有：①雾化感染。用人型结核杆菌H37Rv 诱导BALB/c 系小鼠建立肺结核动物实验模型，使用5 mL 雾化液（细菌+生理盐水）雾化90 min 后雾化液无残留，可见感染动物明显体毛湿润即可；②静脉感染法。将经过小鼠体内毒力复苏的MTB 菌株，转种于改良罗氏固体培养基上，37℃保湿培养约20 d。然后刮取生长良好的干菌落放入研磨器中，同时加入经过灭菌的含0.05%的吐温-80 的生理盐水，然后研磨成菌悬液，菌悬液浓度可通过荧光染色后镜下计数或比浊法进行确定，然后通过尾静脉注射或腹腔种植到小鼠体内；③气溶胶途径感染法。将模型动物全部或仅将鼻子暴露于气溶胶中使其通过呼吸道被感染。

1.2 方法评价

肺结核是由结核杆菌感染而引起的一种慢性传染病。接触致病菌2 周期间，致病菌在接种与未接种卡介苗的豚鼠中以同样的速度繁殖，然后繁殖减慢。首先见于接种过高效卡介苗的动物，几天以后见于接种过低效卡介苗的动物，最后，未接种卡介苗而给予安慰剂的动物也出现病菌繁殖减慢。感染24 d 以后，将接种过与未接种过卡介苗的动物处死，呈现原发病灶邻近组织损伤。将2～4 个致病结核杆菌气雾吸入12～14 周以后处死动物，未接种过卡介菌的动物肺内有明显空洞，而接种过卡介苗的动物却没有，吸入低度感染气雾以后3 周，未接种过卡介苗的动物中有相当数量的结核杆菌进入血液循环，而且又回到肺，使每个肺叶存活的结核杆菌超过100 个病灶。经过一段时间血源播散导致结核杆菌繁殖，形成继发病灶，而接种过卡介苗的豚鼠明显地减少和延缓了空气传播结核杆菌菌血症期。①雾化感染法［1］：操作方便。②静脉感染［2］：经小鼠尾静脉进行接种4 周后即可建立稳定的感染，持续带菌4周以上，8 周后，小鼠肺、脾荷菌数达高峰并刺激机体产生强烈的体液和细胞免疫应答，其应答水平与体内荷菌数呈正相关，建立的结核分枝杆菌持续感染小鼠模型在结核病疫苗和治疗药物的研发及筛选中具有一定的应用价值。静脉注射或腹腔种植的优点是操作简便、相对安全、细菌定量准确。③气溶胶感染［3］：气溶胶感染为当前国际上最为流行的一种MTB 经呼吸道感染的方式，其方法为在一个密闭空间内注入MTB 气溶胶，将小鼠全部或仅将鼻子暴露于气溶胶中使其通过呼吸道被感染。感染剂量可通过调节感染时间或细菌浓度来实现。

2 动物的选择

2.1 豚鼠［4］

豚鼠对结核分枝杆菌高度敏感，其感染后的病理改变酷似人类，且模型存活率高，是目前国际公认的建立结核病实验动物模型的最佳选择［2］。豚鼠最常见的感染途径是气溶胶吸入，也可采用静脉注射的方式，如经前肢、腹股沟或大腿内侧皮下和腹腔等。低剂量结核分枝杆菌就能使豚鼠发展成与人类相似结构典型的肉芽肿，呈现出人类肉芽肿中常见的朗格汉斯多核巨细胞，进而发生液化坏死。豚鼠模型可复制人类感染结核分枝杆菌的许多方面，特别是儿童和免疫功能缺陷患者的结核病。因此，豚鼠在研究结核分枝杆菌呼吸道传播、肉芽肿形成和干酪样坏死方面具有重要价值。

2.2 小鼠

小鼠体型小、价格低廉、种群数量庞大、生长繁殖快，小鼠对结核分枝杆菌较其他动物不够敏感，其肺内可耐受相对大量的结核分枝杆菌，其他器官无结核病症状。给予相对低剂量的结核分枝杆菌气溶胶（约50 CFU）经呼吸道感染小鼠，可成功建立自然复发和药物诱导复发的潜伏期感染动物模型，感染剂量可通过调节暴露感染时间和菌液浓度来实现。C57BL/6 品系小鼠因其易建立结核分枝杆菌感染且脏器荷菌量相对较高的特点，成为结核病发病机制研究和药物筛选中最常选用的动物［5-7］。

2.3 兔

对牛分枝杆菌极其敏感，且吸入牛分枝杆菌后引起的肺部病变更接近于人类，易形成空洞，引起结核分枝杆菌在支气管播散。兔子可以发展出与人类类似的肺结核的疾病，即具有干酪样坏死，液化和蛀牙的肉芽肿。肺部感染途径以气溶胶多见，也可皮内注射造成皮肤结核模型［8］。

2.4 非人灵长类

非人灵长类对结核分枝杆菌易感，且其具有与人相似的生理和遗传特征，能通过与人相似的感染途径发展类似人类的疾病，无可争议地成为人类结核病基础及临床前研究最理想的动物模型。但非人灵长类模型数量有限、价格昂贵、操作困难，感染模型的建立依赖BSL-3 实验室；且非人灵长类对结核分枝杆菌高度易感，容易引起疾病暴发，因此限制了其在临床前期试验。用低剂量气溶胶感染猕猴、恒河猴，能复制人类结核病潜伏期感染和复发表现［5］。

2.5 斑马鱼

斑马鱼具有体型短小、易于饲养、繁殖能力强及基因组与人类相似的特点，海鱼分枝杆菌和嗜血分枝杆菌对斑马鱼具有高致病性，感染后形成的结核肉芽肿与人类肺结核肉芽肿一样，会发生干酪样液化坏死［9-11］。

3 诱发肺结核动物模型方法

3.1 卡介苗气溶胶感染致小鼠肺结核模型

许怡［12］等人将4 周的C57BL/6 小鼠暴露于BCG气溶胶30 min·d-1，连续3 d，并通过组织切片、苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色和抗酸染色观察小鼠肺组织病变及结核菌数和分布情况。结果实验组小鼠肺组织可见多处炎症细胞浸润，呈慢性炎症。小鼠肺组织切片抗酸染色，可见结核杆菌，呈弥散分布，成功建立肺结核病动物模型。华树成［1］等人在一个密闭空间内注入MTB 气溶胶，将小鼠全部或仅将鼻子暴露于气溶胶中使其通过呼吸道被感染，将小鼠随机分成实验组及对照组，每组5 只。从低温冰箱内提前取出菌，并置于CO2培养箱（37 ℃、2.5%～3.0% CO2）培养1 d。加入0.05%吐温-80 的生理盐水，6 000 r·min-1，15 min，离心弃上清，再加入0.05%吐温-80 的生理盐水，制成细菌悬液，用2 MCF比浊管比浊，确定菌液浓度为1.41×106CFU·mL-1，加入4.5 mL 0.05%吐温-80 的生理盐水，雾化实验组小鼠30 min。对照组小鼠，置于雾化盒内，用4.5 mL 0.05%吐温-80 的生理盐水同样雾化30 min。小鼠饲养4 周，4 周后断颈处死，每周定期称量体质量，取小鼠的肺组织，实验组小鼠肺组织可见多处炎症细胞浸润，呈蜂窝状排列，炎症细胞大量聚集于气管周围，其旁有较多的血管，血管粗大，部分无明显的肺泡结构，呈慢性炎症。

3.2 小鼠尾静脉注射致肺结核模型

梁艳［13］等人将54 只小鼠（C57 BU6）随机分为对照、尾静脉注射和腹腔注射3 组；感染鼠分别通过尾静脉注射或腹腔注射3H7vR 标准株结核分枝杆菌菌液2×106CFU·mL-1，以生理盐水尾静脉注射为对照；在感染后3 周、6 周及9 周取小鼠脾脏和肺脏做细菌计数和肺组织病理学检测，并观察小鼠体质量，存活状况。结果结核菌感染鼠中，以尾静脉注射组小鼠的活动状态及体质量均差于腹腔注射组；两组脾脏和肺脏组织中结核菌计数差异具有显著性（P＜0.05）；组织中结核结节及干酪样坏死病灶亦以尾静脉注射组为明显，结论以尾静脉注射法建立结核分枝杆菌急性感染的小鼠模型更为有效。吕燕［14］等人将24 只BALB/c 小鼠随机分为感染组和对照组，感染组尾静脉注射H37Ra 菌液106CFU·0.2 mL-1，对照组注射等量生理盐水，感染4 周及8 周分别取小鼠的肝脏、肺脏及肾脏组织，切片HE 染色，组织匀浆液接种罗氏培养基培养；取小鼠骨髓细胞和脾脏细胞经荧光抗体染色，采用FACSCalibur分析感染早期及晚期小鼠的B 淋巴细胞表型。结果感染组小鼠肝脏、肺脏及肾脏肿大，培养后均有H37Ra 菌株生长，成功建立了H37Ra 感染BALB/c 鼠模型；小鼠被H37Ra 感染后影响了B 淋巴细胞的分化发育，促使B 淋巴细胞向成熟阶段分化，为机体抵御H37Ra 感染奠定了基础。

3.3 家兔气溶胶感染致肺结核模型

Dorman［8］等人使用不同剂量的牛分枝杆菌强毒株气溶胶感染新西兰兔，低剂量（吸入220～880 个分枝杆菌单位）和高剂量（吸入3 900～5 800 个分枝杆菌单位）感染都可使其发展为液化型坏死和肺空洞，肺空洞最早形成于感染后6 周。将（1.08±0.31）×103CFU·mL-1结核分枝杆菌CDC1551 感染新西兰白兔，在感染后第4 周感染兔子的肺匀浆培养结核分枝杆菌量达到峰值（3.0±1.3）×105CFU·mL-1，以后持续下降至第24 周时肺匀浆培养全为阴性。如果使用糖皮质激素可以诱导结核复发，肺匀浆培养结核分枝杆菌再次出现阳性并持续升高一段时间［15］。

总之，建立适合的肺结核动物模型，有助于抗肺结核药物的研发，具有深远意义。