诱发肺纤维化动物模型方法及评价

2019-02-11张丹参马佳呈

神经药理学报 2019年6期

张丹参马佳呈

1.河北科技大学，石家庄，050018，中国

2.河北北方学院药学系，张家口，075000，中国

肺纤维化是一组以肺间质弥漫性渗出、浸润和纤维化为主要病变的疾病，包括特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）和继发性肺纤维化（secondary pulmonary fibrosis，SPF）［1］。其发病病程较长，表现为进行性肺间质纤维组织增生，肺泡壁显著增厚，肺毛细血管床减少，导致肺静脉、肺动脉高压，严重可至右心衰竭。其临床症状主要为咳嗽、呼吸困难、低氧血症，终末期患者会因呼吸衰竭而亡。肺纤维化发病机制复杂，病情进展不可逆，愈后极差，尽管世界各国科学家们针对肺纤维化积极探索，但目前仍无有效治疗方案［2］。特别是在2003 年初发生的严重急性呼吸道症候群（severe acute respiratory syndrome，SARS）中，很多病人出现的肺损害都以肺纤维化为病理特征。因此，为了研究其发病机制及临床治疗，建立一种简便、快速、有效的动物模型是非常有意义的。本文通过对肺纤维化动物模型的相对全面的介绍，特别是对相关模型的评价，为研究肺纤维化发病机制和临床治疗提供理论基础。

1 动物的选择

动物模型是研究肺纤维化的一个重要工具，它为探索特发性肺纤维化和其他肺纤维化疾病发病机制及寻找治疗这些破坏性疾病方法提供重要线索。在动物筛选方面，需要筛选出肺纤维化特征更精确，其模型病理过程更符合人类肺纤维化病理过程的动物［3］。

目前，肺纤维化动物模型有采用体型较小鼠类（如小鼠、大鼠、仓鼠［4］等）和兔［5］。其中C57BL/6 小鼠、BALA/C 小鼠、KM 小鼠和ICR 小鼠，Wistar 大鼠和SD 大鼠是用于肺纤维化模型最常用的种类［6］，也有选用体型较大的犬［7］、猪［8］、羊［9］和灵长类动物［10］等，模型选用的动物种类因研究目的和造模方法不同而异。

鼠类是较多选用的肺纤维化动物模型，体型小、体重轻、价格便宜，有气管灌注［11］、雾化吸入［12］、经鼻给药［13］、腹腔注射［14］、静脉注射［15］等多种给药方式，是常用的造模动物［16］，但因其体型太小不适用于放射影像学的研究，需要通过解剖摘取肺部进行组织病理学检查的方法判断造模是否成功。鼠肺纤维化模型是精确显示肺纤维化患者的重要特征，小鼠和大鼠气管给药所致模型的病理状态与临床相近［17］。国内特发性肺间质纤维化实验多采用Wistar 大鼠，C57BL/6 小鼠较BALB/C、KM、ICR 小鼠更容易复制出特发性肺间质纤维化模型［18］。

猪、猴等大型动物体型大，心脏及肺部组织结构与人相似，并且可通过影像学方法在无创条件下动态观察动物造模情况，但价格昂贵，操作较复杂。

2 诱发肺纤维化动物模型方法

为了阐明肺纤维化的发病机制和寻找新的药物靶点，目前已建立多种诱发动物肺纤维化模型的方法，包括基因相关模型与非基因相关模型［19］。基因相关模型是指通过基因工程使动物成为肺纤维化模型，而非基因相关模型是指在相同或相似的遗传背景下，通过环境因素、药物毒物或其他因素诱导得到的肺纤维化模型。

2.1 基因相关方法致肺纤维化模型

基因相关方法包括转基因法与基因突变法，而转基因方法又包括细胞因子过表达法、靶向Ⅱ型肺泡上皮细胞损伤法［19］。利用转基因技术过表达细胞因子造成严重的肺纤维化，主要细胞因子包括转化生长因子-α（transforming growth factor-α，TGF-α）、TGF-β、白细胞介素-13（interleukin-13，IL-13）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）和IL-1β等［20］。靶向Ⅱ型肺泡上皮细胞损伤法是利用转基因技术将白喉毒素受体与Ⅱ型肺泡上皮细胞启动子通过载体融合，白喉毒素不断刺激转基因小鼠，致肺纤维化。通过敲除特定基因或导入突变基因使基因突变也能建立肺纤维化动物模型，与肺纤维化有关的基因包括：肺表面活性蛋白C（surfactant protein C，SFTPC）、肺表面活性蛋白A2（surfactant protein A2，SFTPA2）、端粒酶逆转录酶（telomerase reverse transcriptase，TERT）和端粒酶RNA复合酶（telomerase RNA complex enzyme，TERC）［21］。

基因技术造模方法比较于传统造模方法，靶点明确，对筛选抗纤维化药物意义重大。除此之外，通过诱导时间特定启动子，可模拟肺纤维化晚期出现的临床症状。但介导转基因用的病毒载体本身具有潜在危害性，且人类肺纤维化是多基因多种因子作用的结果，因此单一的基因模型与多基因相关的肺纤维化模型存在一定差异。而基因突变模型不能自发形成肺纤维化，需要联合使用低剂量博莱霉素诱导［22］。

2.1.1 SD 大鼠细胞因子过表达法致肺纤维化模型［23］

AdTGF-β1223/225 及腺病毒空载体-70℃保存，临用前经病毒稀释液稀释成1×109pfu（病毒稀释液由三种溶液构成，其配制方法：A 液：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO41.15 g，KH2PO40.2 g，加双蒸水定容至100 mL，高压消毒；B 液：CaCl2·2H2O 0.1 g 定容至10 mL，高压消毒；C 液：MgCl2·6H2O 0.1 g 定容至10 mL，高压消毒。用前取98 mL A 液、1 mL B 液、1 mL C 液混合备用。选用SD 大鼠，体质量（250±15）g，腹腔注射速眠新麻醉（0.4 mL·kg-1），无菌操作，剪开颈部皮肤，钝性分离颈部肌肉，充分暴露气管，经喉头下一次性注入0.4 mL AdTGF-β1223/225 腺病毒液，手术6 h 后观察并记录动物生理反应。分别与造模后d 7、d 14、d 21，麻醉后开胸，左心室插管，先灌流温热（室温）生理盐水，剪开右心耳放血，待流出液变澄清后再缓慢灌流4%多聚甲醛水溶液（200 mL·30 min-1）。小心摘取整个肺和心，经气管恒压（2 452 Pa）灌注4%多聚甲醛固定液10 min，使肺泡恢复扩张状态。沿纵轴切取肺组织浸入4%多聚甲醛固定液中固定24 h，做常规石蜡包埋、石蜡切片、HE 染色和Mallory 染色，光镜观察、摄片。

气管内注射腺病毒约12 h 后，表现为呼吸困难、狂燥不安；36 h 后有大鼠因呼吸衰竭死亡，剩余大鼠频繁干咳，背部毛发散乱、竖起，活动量、进食量、进水量均明显减少；72 h 后多数大鼠咳嗽减轻，取食、进水趋于正常，呼吸一直伴随“啰音”。造模d 7 大鼠肺组织出现明显炎症反应，肺泡腔含大量炎细胞渗出物，肺泡上皮细胞多数脱落，肺间隔结缔组织增生，细支气管周围出现肺泡塌陷，胸膜明显增厚，造模d 14 大鼠肺组织炎症反应强烈，少数肺泡结构破坏，肺间隔显著增厚，肺组织出现局部纤维化病灶区，胸膜进一步增厚，造模d 21大鼠肺组织，纤维化灶进一步扩大，胸膜显著增厚，肺间质出现大量走行不规则的胶原纤维。

2.2 非基因相关方法致肺纤维化模型

常用的非转基因方法主要为物理化学方法，包括博莱霉素诱导法、平阳霉素诱导法、百草枯诱导法、石棉诱导法、辐射诱导法。化学诱导法及石棉诱导法通常通过皮下、静脉注射，或者雾化吸入等途径给药，辐射诱导法则直接进行射线照射。

2.2.1 博莱霉素致肺纤维化模型

目前博莱霉素诱导肺纤维化有气管内一次给药［24-25］或多次给药［25］，也有腹腔给药［25］、鼻内给药［13］、静脉给药［25］、雾化吸入［25］多种方式。气管内一次给药是最常用的造模方式［26］。

博莱霉素肺纤维化模型易于操作，可重复性好，其病变过程与人类肺纤维化的自然过程相似，也表现为进行性及不可逆性。博莱霉素所致的SD 大鼠肺纤维化模型有较强的可重复性［27］。气管内一次给药法有给药次数少、剂量小、制模时间短等优点，但动物死亡率较高，操作复杂，急性肺损伤程度重、胶原代谢紊乱的程度轻，病灶分布不均，以支气管周围为显著的特点［24-25］。目前一次性气管内灌注博莱霉素诱导的动物肺纤维化是国内外最常用、最受认可的肺纤维化模型［28］。腹腔内给药法具有给药次数多、剂量大、制模时间长等缺点，但动物死亡率相对较低，且操作简便，急性肺损伤程度较轻、胶原代谢紊乱的程度较重，病灶分布均匀，以胸膜下为显著的特点［24-25］。

2.2.1.1 大鼠气管内注射博莱霉素致肺纤维化模型大鼠气管内注射博莱霉素诱发肺纤维化。选用健康雄性8～10 周龄Wistar 大鼠，体质量（250±50）g，用10%水合氯醛（0.3 mL·100 g-1）腹腔内注射麻醉，将大鼠仰卧固定于实验台，开口器固定口腔，拉出舌，用压舌板压舌腹，在额镜直视下，趁动物吸气瞬间迅速行气管插管（Ф 2 mm，4～5 cm），缓慢注入5 mg·kg-1BLM 0.2～0.3 mL，立即旋转动物，使药液在肺内均匀分布，自由饮水、摄食，d 1、d 14、d 28 采集标本。气管注入博莱霉素2 周时，可见肺系数、羟脯氨酸（hydroxyproline，HYP）含量明显升高。在第4 周时，肺系数、HYP 含量持续增高，Masson 三色法染色可见肺间质内有大量散在绿染的胶原纤维，肺泡结构破坏。炎症细胞浸润明显少于2周时，可见很多纤维细胞，为Ⅲ～Ⅳ级肺纤维化表现［24］。

2.2.1.2 仓鼠气管内注射博莱霉素致肺纤维化模型取10 周龄雄性叙利亚仓鼠，用生理盐水配制1 U 博莱霉素溶液，单次气管内注射0.1 mL，注射药物3 周后，取肺组织进行细胞原代培养，3H-TdR 整合实验评估成纤维细胞增殖效果［4］。

2.2.1.3 大鼠腹腔内注射博莱霉素致肺纤维化模型选用健康雄性8～10 周龄Wistar 大鼠，体质量（250±50）g，每日腹腔注射15 mg·kg-1BLM 10 天，自由饮水、摄食，d 1、d 14、d 28 采集标本。自d 1、d 14 HYP 含量升高，d 28 达到高峰，d 14 出现肺泡间隔水肿，炎性细胞浸润，以单核-巨噬细胞及中性粒细胞为主，d 28 炎性细胞减少，成纤维细胞增多［24］。

2.2.1.4 小鼠气管内注射鼻腔滴入博莱霉素致肺纤维化模型选用SPF 级雌性ICR 小鼠，6～8 周龄，体质量16～18 g，适应性饲养1 周后，鼻腔滴注博莱霉素造模。用乙醚麻醉小鼠，后用微量移液器吸取50 μL 博莱霉素溶液（15 mg·kg-1进行干预），经鼻腔缓慢滴入小鼠气管内，放入鼠笼内安置，观察其造模后一般情况。造模后活动减少，呼吸急促，反应灵敏度变差，毛发干燥晦暗，严重者可见斑秃、脱毛，进食下降，体质量逐渐减轻。d 7 时双肺充血水肿，可见密集的点状、弥漫性出血，体积变大，肺脏出现明显的急性炎症，肺泡间隔增宽，肺泡腔内可见炎性细胞浸润；d 14 双肺弹性下降，局部见大小不等点状出血，结节样改变，肺泡壁结构破坏，肺泡间隔明显增宽，肺泡腔内仍有大量炎性细胞浸润，间质出现成纤维细胞增生；d 28 时双肺萎缩、苍白，弹性变差，质地坚韧，表面出现灰白色结节及条索状改变。肺泡炎减轻，肺泡腔萎缩、消失，肺泡壁增厚，肺间质大量纤维成分沉积，肺纤维化明显加重。Masson 染，d 7时蓝染部位较少；随着病情的进展，小鼠肺组织内的蓝色胶原纤维逐渐增多；d 28 时模型组小鼠的肺泡结构完全被破坏，肺野内有大量蓝色胶原纤维沉积，肺泡间隔也几乎被蓝染的胶原纤维充填［13］。

2.2.2 平阳霉素致肺纤维化模型

平阳霉素是一种抗肿瘤抗生素，具有肺毒性，文献中通常采用大小鼠气管注射或雾化吸入的方式建立肺纤维化模型。

在雾化吸入或气管内滴入平阳霉素后15 d，肺组织形态学特点为肺泡壁增厚、肺胞腔变小，其内充满中性粒细胞、单核细胞等炎性细胞，呈Ⅲ级肺泡炎改变。脂质过氧化物（lipid peroxide，LPO）明显升高。30 d 时，肺泡间隔增宽，气管及血管周围单核细胞、淋巴细胞等炎性细胞浸润，并见成纤维细胞和胶原纤维增生和聚集，呈Ⅰ级纤维化改变，此时LPO 含量与对照动物无显著差异［29］。

2.2.2.1 大鼠气管穿刺注入平阳霉素致肺纤维化模型选用SPF 级SD 大鼠，体质量（200±20）g，将平阳霉素用生理盐水配成5 g·L-1的溶液。10%水合氯醛（0.3 mL·100 g-1）麻醉大鼠，颈部皮肤消毒，剪去颈部鼠毛，行颈正中切口，分离暴露气管，经气管软骨环间隙向心端穿刺，注入平阳霉素5 mg·kg-1，立即将动物直立并旋转，使药液在肺内分布充分、均匀，缝合皮肤，自由饮水、摄食，保持自然光照，d 28 采集标本［30］。

2.2.2.2 大鼠雾化吸入平阳霉素致肺纤维化模型张纾难等人也选用了用平阳霉素雾化致大鼠肺纤维化的方法。将Wistar 大鼠，体质量（200±20）g，放入长、宽、高各40 cm 玻璃缸内，玻璃缸与超声雾化器相连通，通过雾化管向缸内喷入雾化液，缸上盖薄塑料板，板上留一个小的通气孔。将平阳霉素和生理盐水配成2 mg·mL-1的溶液，雾化吸入10 min。自由饮水摄食，d 28 采集标本［31］。

2.2.3 百草枯致肺纤维化模型

近年来，国内不少研究者使用百草枯诱导动物肺纤维化。百草枯的靶器官为肺脏，使用百草枯诱导动物肺纤维化常选用的动物有小鼠、大鼠、家兔等，通常采用一次性口服灌注和腹腔注射［32］。

百草枯为联吡啶类化合物，化学名1，1’-二甲基-4，4’-联吡啶鎓盐，是一种速效触杀除草剂，与其它毒物不同，百草枯中毒除急性死亡外，非急性死亡的病人多在15～30 d 发生肺纤维化。继发性损伤产生肺纤维化多在中毒后5～9 d 内发生，2～3 周达高峰［33］。百草枯致肺纤维化的发病机制是其吸收后经复杂的生化过程产生大量的氧自由基，引起器官组织细胞脂质氧化，这是多器官损伤的基础。肺泡细胞对百草枯具有主动摄取和蓄积作用，故肺脏受损最突出而严重，最终导致纤维化［34］。一次性口服百草枯是一种简便、快速、典型的肺纤维化造模方法，小鼠3 周时即可造成肺纤维化模型，可用来进行肺纤维化的发病机制和药物疗效的研究。

2.2.3.1 小鼠口服百草枯致肺纤维化模型预实验研究中，昆明小鼠口服百草枯的LD50 为137.3 mg·kg-1，给予百草枯后小鼠全部存活的最高剂量为100 mg·kg-1，故确定百草枯的给药剂量为100 mg·kg-1。KM 小鼠，体质量（20±2）g，禁食16 h 后，一次性灌胃20%百草枯水溶液后正常进食、饮水。给予百草枯灌胃后，动物表现不同程度的眯眼、呆滞、拱背、毛枯等现象，大约在6 d 后逐渐恢复正常。肺组织病理改变光镜下观察，造模3 d已出现严重炎性反应，静脉淤血和局部出血，中性粒细胞轻度增多，纤维母细胞增多，肺局部纤维组织增生；7 d时出现慢性炎症，出血，局部区域可明显见纤维组织增生，间质增厚，同时可见中性粒细胞，巨嗜细胞，纤维母细胞增生；d 14 支气管扩张，肺泡上皮增生，间质增厚，淋巴细胞、巨噬细胞、纤维母细胞增多；d 21 时出现较大范围慢性炎性灶，在肺实质有较大范围纤维增生，肺组织部分实变，纤维母细胞、巨噬细胞、淋巴细胞减少，肺组织呈现明显的纤维化改变；42 d 时淤血，肺局部间质增厚［35］。

2.2.4 石棉微粒致肺纤维化模型

石棉颗粒是一种工业粉尘，石棉纤维的沉积通过诱导肺泡上皮细胞凋亡，巨噬细胞的M2 极化，以及激活T 细胞过度产生亲纤维化细胞因子，导致肌成纤维细胞分化和细胞外基质生成，从而致肺纤维化［36］。常用环甲膜穿刺法或用＜5 μm 直径的石棉颗粒直接灌肺建立肺纤维化模型［37］。

石棉纤维经气管内单次灌注给药是一种相对快速的纤维化造模方式，操作简便、快速、成功率高。由气管开口直接注入，对动物机体损伤小，灌肺72 h 内没有死亡。在灌肺后8 周Gommor 结缔组织特殊染色法证明，肺泡壁、毛细血管及小气管周围有大量绿色的纤维组织增生，病理改变典型，构成了良好的肺纤维化模型［37］。但是，病变在肺叶间的分布是不均匀的，其纤维化的分布往往集中在肺组织中心而不是胸膜下，与人类IPF 的病理改变不相符。吸入方法诱导的的纤维化病变更接近胸膜，然而该方式可能需要1 个月，尤其是使用温石棉［38］。

2.2.4.1 大鼠肺注入石棉微粒致肺纤维化模型取石棉成品，经研磨，用200 目钢筛滤过、水选，制备石棉微粒。95%以上石棉粉尘微粒直径＜5 μm，用生理盐水配成20 mg·mL-1的浓度，经高压灭菌备用。选用Wistar大鼠，雌性，体质量（180～200）g，将Wistar 大鼠置密封罐中，滴入乙醚，待充分麻醉后，将20 mg·mL-1的石棉生理盐水1 mL，人耳镜插入大鼠气管开口，确认声带活动后，用腰分针（折去头），直接注入肺内，轻揉双肺片刻。在2、4、6、8 周分别处死后，立即取大鼠肺、心、肝、肾等组织浸泡在福尔马林内。经改良的Gommor 结缔组织特殊染色，胶原纤维、网状纤维、盐基颗粒呈绿色；肌纤维、纤维素、神经胶质纤维、黏液、红细胞等是深浅不同的鲜粉红色。动物在灌肺后72 h 内无死亡。各时间段大鼠肺脏的肺泡间隔增宽，炎细胞浸润，第8 周病理显示炎细胞有减少趋势。吞噬细胞反应活跃，部分吞噬细胞落入肺泡腔内，有的形成粉尘细胞。2、4、6 周的肺脏绿色的纤维组织逐渐增多，8 周实验组的支气管及伴随的小血管周围，经特殊染色证实其周围的纤维结缔组织明显增多，有纤维化形成［37］。

2.2.5 辐射诱导法致肺纤维化模型

研究认为放射诱导肺纤维化的病理生理机制涉及自由基介导的DNA 损伤和诱导TGF-β表达，导致肺泡Ⅰ型上皮细胞的亚临床损伤，临床表现为放射性肺炎。由于异常的修复，使得放射性肺炎向纤维化发展［36］。

肺脏病变初期呈急性变化，以后转为亚急性或慢性进行性发展过程，可大致分为2 个阶段4 个期。早期即急性炎症期或渗出期，中期为增生期，这2 期构成疾病的第1 阶段，称为放射性肺炎；后期即纤维化期，晚期即胶原化期，这2 期共同构成本病的第2 个阶段，称为进行性间质纤维化阶段［39］。

2.2.5.1 大鼠辐射诱导法致肺纤维化模型选用雌性Wistar 大鼠，体质量（220±20）g，无异常者进行60 Coγ射线全胸单次照射，照射野为4.5 cm×4.0 cm，照距为3 m，剂量率为2.7 Gy·min-1，剂量为30 Gy。照射时，将大鼠上至两腋窝、下至胸骨剑状突的位置对准此照射野，用10 cm 厚铅砖屏散装置屏蔽大鼠其余部分，照射后随机分笼喂养。分别于照后3、7、14、21、28、42、56、70、90、180、270、365 d 共12 个时间点进行取材观察。取各时间点肺脏经病理宏观检查后，固定于12%缓冲中性福尔马林中，用常规法制成石蜡切片，经HE染色后进行光镜观察。照射后第3 周，动物胸背部照射野皮肤开始脱毛，鼻腔出现出血现象，肺脏表面和切面散在点状或斑点状出血。约1 个月左右胸背部照射野皮肤脱毛明显，该处皮肤发生湿疹、红斑、糜烂和溃疡，鼻腔出血更加严重。胸腔积少量或多量淡黄色或红黄色液体，肺脏充血、出血、肿胀，切面有大量泡沫样液体流出，肺体积增大、重量增加。肺重与体重之比也明显增高，可达3%，最高达4.9%。3 个月后，脱毛及鼻腔出血有所减轻，但鼻腔出血仍不时可见，肺脏的急性炎症性变化明显减退，成纤维细胞大量增生。动物死亡从3周后开始可持续到照后3.5 个月，死亡高峰集中在照后1.5～2 个月。6 个月后，被毛重新长出，肺脏可见灰黄色或灰白色的绿豆大到蚕豆大的致密实变区，尤左、右肺上叶表现明显，纤维细胞明显增多，发生局灶性纤维化［39］。