清香型白酒酿造过程中可培养高温放线菌的分离与鉴定

魏金旺

（北京顺鑫农业股份有限公司牛栏山酒厂，北京101301）

高温放线菌属(Thermoactinomyces)于1899年由Tsiklinsky首次描述，是20世纪前人类所发现的为数不多的几个放线菌属之一[1]，其分类地位属于细菌域（Domain Bacteria）后壁菌门（Phylum Firmicutes）芽孢杆菌纲（Class Bacilli）芽孢杆菌目（Order Bacillales）高温放线菌科（Thermoactinomycetaceae），虽然其在形态学上接近放线菌，但在分子分类上更接近于细菌类群，过去很多学者认为它是一个典型的介于细菌和放线菌之间的特殊类群。该类微生物在自然界中广泛分布，常见于高温环境，如陆生性热泉、高温大曲、堆肥、稻草、甘蔗渣等，可在土壤、水或海洋基质中存活[2]。

近几年来，随着分子生物学的普及和传统分离方法的发展，越来越多的高温放线菌类群在高温或中高温大曲中分离获得，如刘洋等[3]从芝麻香大曲中分离到1株嗜热放线菌，并结合16S rRNA、形态学及生理生化鉴定为普通高温放线菌（Hermoactinomyces vulgar)；于华等[4]通过稀释涂布划线法、平皿生化反应及分子生物学鉴定，从酱香大曲中分离纯化1株高温放线菌娄彻氏链霉菌（Streptomyces rochei）；李豆南等[5]从高温酱香大曲中分离到1株耐热性良好的放线菌，经过形态学、生理生化及16S rRNA分子生物学鉴定，确定其为糖莱斯氏菌（Laceyella sacchari）。中高温大曲制曲温度往往可达到60℃以上，为高温放线菌提供了适宜的生长环境，而清香型大曲则属于中低温大曲，其制曲温度往往在40℃左右，目前还尚未见高温放线菌分离报道，所以对清香型大曲进行高温放线菌的研究，有助于解析清香型大曲微生物多样性，丰富清香型酿酒微生物类群。

1 材料与方法

1.1 材料

牛栏山酒厂清香型大曲、发酵酒醅。

1.2 主要仪器与试剂

BSC-1100ⅡA2型生物安全柜，北京东联哈尔仪器制造有限公司；梯度C1000快速梯度基因扩增仪，美国BIORAD公司；基础型水平电泳仪，美国BIORAD公司；全自动凝胶成像仪，美国BIORAD公司；1-14k高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；YXQ-LS-75Ⅱ型数显立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅；SPX-320型生化培养箱，宁波江南；PLR-1006 4℃实验室冰箱，赛墨飞世尔。

1.3 分离培养基

改良高氏二号培养基：葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，胰蛋白胨3 g，NaCl 5 g，琼脂20 g，水1 L，pH 7.2，营养液10 mL，121℃灭菌20 min，冷却50℃后加入1 mL（50 mg/mL）萘啶酮酸、0.4 mL（20 mg/mL）两性霉素后倾倒平板。

ISP2培养基：Yeast extract 4 g，Malt extract 5 g，Dextrose 4 g，Agar 18 g，pH7.3，营养液10 mL，水1 L，121℃灭菌20 min，冷却至50℃后加入1 mL（50 mg/mL）萘啶酮酸、0.4 mL（20 mg/mL）两性霉素后倾倒平板。

ISP5培养基：L-asparagine 1 g，丙三醇 10 g，K2HPO41g，琼脂 15 g，pH7.2～7.4，营养液 10 mL，水1 L，121℃灭菌20 min，冷却至50℃后，再加入1 mL（50 mg/mL）萘啶酮酸、0.4 mL（20 mg/mL）两性霉素后倾倒平板。

ISP4培养基：可溶性淀粉10.0 g，K2HPO41.0 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，NaCl 1.0 g，(NH4)2SO42.0 g，Ca-CO32.0 g，FeSO4·7H2O 0.001 g，MnCl2·7H2O 0.001 g，琼脂20.0 g，营养液10 mL，水1 L，121℃灭菌20 min，冷却至50℃后加入1 mL（50 mg/mL）萘啶酮酸、0.4 mL（20 mg/mL）两性霉素后倾倒平板。

ISP6培养基：细菌蛋白胨36 g，酵母提取物1 g，pH 7.0～7.2，水1 L，营养液10 mL，121 ℃灭菌20 min，冷却至50℃后加入1 mL（50 mg/mL）萘啶酮酸、0.4 mL（20 mg/mL）两性霉素后倾倒平板。

LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，营养液10 mL，水1 L，121 ℃灭菌20 min，冷却50℃后加入1 mL（50 mg/mL）萘啶酮酸、0.4 mL（20 mg/mL）两性霉素后倾倒平板。

营养液：大曲粉10 g，高粱粉10 g，水500 mL，煮沸后过滤去沉淀，121℃灭菌20 min。

1.4 实验方法

1.4.1 样品采集

采集牛栏山酒厂成品大曲5块，粉碎后充分混匀，取混合样品100 g；取牛栏山冬季发酵时间为3 d、7 d、13 d、23 d的酒醅各100 g。

1.4.2 微生物分离、培养、计数及保藏

样品预处理：分别称取大曲、不同发酵时间酒醅样品10 g与90 mL无菌水混匀，拟定为10-1浓度，55℃、200 r/min水浴30 min，使蕴含在样品中的微生物充分释放，同时杀灭不耐高温的细菌、真菌等微生物[6]。

微生物分离：采用稀释涂布法分离，吸取1 mL上述处理好的样品于9 mL无菌水中，为10-2，依次稀释为10-3、10-4梯度。吸取不同梯度液各0.1 mL，涂布相应固体分离平板中。

培养：平板于45℃恒温培养箱中倒置培养，培养时间根据菌落的生长情况而定，一般为3～6 d。

挑菌：准确获得大曲及酒醅中耐高温放线菌，挑菌方法为：挑选菌落数在10～50之间的不同培养基平板，挑取平板内所有微生物，其余梯度随机挑选多样性菌落。挑取的菌落接种到相应培养基中，45℃培养3～5 d，挑取活化后菌体一环进行DNA提取，其余菌体于-80℃甘油中冻存。

1.4.3 系统发育分析

DNA提取方法：挑取少量活化的菌体，于已灭过菌的1.5 mL离心管内；加入100 μL裂解液（100 mM Tris，20 mM EDTA，0.5%SDS，pH 8.0，15磅灭菌20 min备用）；100 ℃水浴15 min；加入100 μL 2.5 M的醋酸钾溶液，冰浴60 min；4℃下12000 r/min离心5 min，取上清液200 μL至0.5 mL离心管中；加入等体积的氯仿-异戊醇（24∶1），剧烈振荡10 min，12000 r/min离心15 min，移取100 μL上清液至0.5 mL离心管中；加入100 μL预冷的异丙醇，混匀后-20℃下放置20 min；12000 r/min离心15 min，弃上清液；用70%的酒精洗涤沉淀2次；沉淀过夜自然干燥；加入50 μL已灭菌的超纯水，室温下溶解1 h，-20℃冰箱储藏备用。

采用细菌16S rRNA通用引物27F/1492R进行PCR扩增，扩增引物序列及PCR条件见表1。

表1 PCR引物及反应条件

PCR产物经电泳检测合格后，送往北京博迈德公司测序，测序后序列用Chromas软件分析测序质量，去除峰图不可靠的部分，对DNA序列进行手动校正，用校正后的序列在美国国家生物技术信息中心(national center for biotechnology information,NCBI)网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）中进行同源序列搜索，比较该菌株在序列上亲缘关系最近的已知信息，包括模式菌株与实验菌株的碱基差异，近缘模式菌株GenBank序列号，可以根据序列同源性初步判断待测菌株的分类地位。

选取同源性较高的典型菌株作为参比对象，用ClustalX软件进行序列比对，并计算供试菌株与参比菌株之间的序列相似性。采用邻接法（Neighbor-Joining），MEGA5.1构建供试菌与参比菌之间的系统进化树。用于检验支持率的重复抽样次数为1000次。

图1 耐高温细菌发育树

表2 高温放线菌种属及酿造过程分布

2 结果与分析

本实验中，采用6种分离培养基，从牛栏山大曲及发酵酒醅中共挑取高温细菌类微生物265株，由于采取了平板10～50以内菌落全部挑取和其余平板随机挑菌的方法，因此本次分离能较为全面地获得了牛栏山大曲及酿造酒醅中耐高温放线菌细菌类群。通过纯化培养及16S测序分析后，从265株细菌微生物中共获得15种微生物，分别标记为GWB1—GWB15，见图1。

由图1可看出，在本次样品中所获得的15种微生物主要为芽孢杆菌、放线菌和高温放线菌，将鉴定结果与分离样品相对比，确定高温放线菌的种属及在酿造过程中的分布情况，见表2。

由表2可知，所分离的3种高温放线菌分别属于高温放线菌科，Shimazuella kribbensis属于岛津氏菌属，目前在白酒酿造中尚未有分离检测报道；Kroppenstedtia sanguinis和Kroppenstedtia eburne同属于克罗彭斯特菌属[7-8]，该菌属在我国芝麻香白酒中有过报道，如姚栗等[9]利用非培养技术研究芝麻香白酒高温大曲细菌群落，发现Kroppenstedtiasp.可占大曲高通量17.38%。

在上述分离结果中，Shimazuella kribbensis、Kroppenstedtia sanguinis和Kroppenstedtia eburne3种高温放线菌在清香型大曲中均能够分离获得，而在发酵阶段，Kroppenstedtia eburne在发酵前期3 d和7 d时可分离得到，其余两种在发酵过程中未能分离得到。

通过以上实验可以得出，高温放线菌不单只存在于高温大曲中，在中低温清香型大曲中同样存在，并且在发酵过程中可以分离检测到。

3 结论

相对于酵母菌、细菌和丝状真菌，放线菌类微生物在白酒研究中报道较少，作为放线菌的分支耐高温放线菌，仅在酱香型或芝麻香型白酒中有过报道，在清香型白酒中尚未有过分离报道。本研究采用传统分离方法，首次从清香型中低温大曲和发酵酒醅中成功分离获得3种高温放线菌S.kribbensis、K.sanguinis和K.eburne，丰富了清香型白酒微生物类群。同时，目前已有部分研究结果表明，部分高温放线菌往往具有纤维素酶、淀粉酶、几丁质酶、PLA酶等活性，其所产生的次级代谢产物往往具有复杂多样的结构和生理活性[10-11]，因此从清香白酒酿造过程中分离并鉴定获得的3类高温放线菌，对清香型白酒酿造及风味研究具有重要的理论研究与实践应用价值。