LC-ESI-M S/M S测定白酒中7种甜味剂的方法研究

周 玉，唐艳荣，余 义，刘 莎，毛从兴，郑 静，孙 琳，刘 艳，时宏伟

（武汉天龙黄鹤楼酒业有限公司，湖北武汉430050）

随着社会发展和科技进步，人们越来越重视饮食健康问题。在食品工业中，甜味剂应用范围较为广泛，且种类较多，按其来源可分为天然甜味剂和人工合成甜味剂；按其营养价值分为营养性甜味剂和非营养性甜味剂，按其化学结构和性质分为糖类和非糖类甜味剂。葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉糖和乳糖等糖类物质，虽然也是天然甜味剂，但因长期被人食用，且是重要的营养素，通常视为食品原料，在中国不作为食品添加剂。属于非糖类的甜味剂有天然甜味剂和人工合成甜味剂。天然甜味剂有甜菊糖、甘草、甘草酸二钠、甘草酸三钾（钠）等。人工合成甜味剂有糖精、糖精钠、环己基氨基磺酸钠、阿力甜等。为此,对于甜味剂合成工艺展开进一步地分析具有一定的现实意义[1-3]。甜味剂尽管应用范围很广，但是在白酒中是不允许添加的[4-5]。

白酒是我国的传统蒸馏酒，按其风味特征可分为各种不同的香型，虽然每种香型各有其典型风格，但是不论哪种香型的白酒，保持适度的甜味，不仅可以遮盖其他一些苦涩杂味，而且还能使酒体甘洌、醇厚、绵软，关键是这种甜味是来自于自然发酵产生的，而非添加甜味剂。

风味化学研究表明，味觉是由一定的呈味物质引起的，酒之所以具有醇甜之感，是因为酒中含有一定量的甜味物质，如高级醇、多元醇、氨基酸等，多元醇的甜味随着羟基数目的增加而加强，如丁四醇的甜味比蔗糖大两倍，己六醇的甜味更强。此外，多元醇都是黏稠体，均能给酒带来丰满、浓厚感，使口味绵长。这些甜味物质，对于名优白酒，是由其特殊的生产工艺决定的，如浓香型大曲酒的低温入池、缓慢发酵，就是为了有利于醇甜物质的生成，无需另行添加[6-8]。

人工合成甜味剂可能对人体有致癌、致病的副作用[9]，因而已被许多国家限制使用。尤其在白酒行业，《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》GB 2760—2014中规定白酒中不得检出甜味剂。所以对于白酒中甜味剂的测定应该做到严格把关，防止行业和白酒企业中出现假冒伪劣产品，对消费者产生不利影响。目前，关于甜味剂的检测方法主要有液相色谱-质谱联用法[10-12]、高效液相色谱法[13-15]、高效液相色谱蒸发散射法[16]、高效毛细管电泳-间接紫外法[18]、核壳型色谱柱-反相高效液相色谱-蒸发光散射检测法[19]、紫外衍生-高效液相色谱法[17]。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

样品：市售白酒样品。

试剂及耗材：三氯蔗糖（规格1 g，储存温度2～8℃，日本和光纯药工业株式会社）；纽甜、阿斯巴甜、阿力甜（规格100 mg，储存温度-20℃，上海安谱实验科技股份有限公司）；安赛蜜、糖精钠、甜蜜素（规格0.25 g，储存温度20℃±4℃，Dr.Ehrenstorfer GmbH）；甲醇（色谱纯，美国Baker公司）；乙酸铵（分析纯，天津市天力化学试剂有限公司）；蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司，规格600 mL）。

仪器设备：Agilent 1260LC-Agilent 6460安捷伦三重串联四级杆质谱仪，安捷伦科技有限公司；Agilent ZORBAX RX-C18安捷伦色谱柱（4.6×50 mm，2.7μm），安捷伦科技有限公司；有机滤膜(孔径0.22μm，天津津腾)；全玻璃微孔过滤器(规格1000 mL)，天津津腾实验设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制

准确称取10 mg(精确至0.0001 mg)纽甜标准品于100 mL容量瓶中，蒸馏水溶解并定容至100 mL)，配制成100 mg/L的标准储备液，置于4℃冰箱中保存。根据需要用蒸馏水逐级稀释成适当浓度的混合标准工作液。

1.2.2 样品前处理方法

用一次性注射器吸取均质样品，经0.22 μm的有机滤膜过滤，滤液供液相色谱-质谱联用仪测定。

1.2.3 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX RX-C18色谱柱(4.6×50 mm，2.7 μm)；流动相：A为0.02 mol/L乙酸铵溶液+0.1%乙酸溶液，B为甲醇；柱温箱：30℃；进样量：5 μL；采用梯度洗脱，洗脱程序见表1。

1.2.4 质谱条件

离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应检测模式；干燥气体温度：350℃；干燥气体流速：8 L/min；喷雾电压：206.8 kPa。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件和质谱条件的优化

表1 流动相梯度洗脱程序

2.1.1 质谱条件的优化

采取直接进样的方式，将目标物标准溶液注入质谱，分别进行正离子模式和负离子模式全扫描检测，得到一级质谱图和准分子离子峰，再用惰性气体氮气攻击该母离子，获得其二级质谱图及相应的子离子。结果表明，在负离子模式下响应值及灵敏度均高于正离子模式，因此，本方法选择负离子电离模式。利用多反应监测模式（MRM）对选定的定性离子和定量离子对碎裂电压、碰撞能、保留时间、碰撞池加速电压等质谱参数进行优化，使各监测离子丰度和信号达到最佳。负离子模式下的质谱分析参数见表2。

表2 7种甜味剂的质谱参数

2.1.2 色谱条件的优化

分别以0.1%乙酸-甲醇、0.1%乙酸-乙腈、2 mmol/L乙酸铵-甲醇作为流动相进行样品分离。结果表明，用2 mmol/L乙酸铵-甲醇作为流动相时物质分离度、峰形、响应值以及保留时间的稳定性均优于0.1%乙酸-乙腈、0.1%乙酸-甲醇，故本方法最终选用2 mmol/L乙酸铵-甲醇为流动相进行洗脱。图1是7种甜味剂在优化的色谱和质谱条件下的MRM色谱图。

图1 7种甜味剂的多反映监测色谱图

由图1可知，安赛蜜的出峰时间为1.4 min，糖精钠的出峰时间为1.5 min，甜蜜素的出峰时间为2.2 min，三氯蔗糖的出峰时间为3.0 min，纽甜的出峰时间为3.7 min，阿力甜的出峰时间为7.0 min，阿斯巴甜的出峰时间为11.7 min。

2.2 线性范围、检出限和定量限

线性范围、检出限和定量限参照梅婕等[20]的方法，将7种甜味剂标准储备液用蒸馏水稀释，分别配制成5种浓度：安赛蜜、糖精钠、甜蜜素和阿力甜10 μg/L、20 μg/L、40 μg/L、100 μg/L、200 μg/L；阿斯巴甜、纽甜 50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L、500 μg/L、1000 μg/L；三氯蔗糖 40 μg/L、80 μg/L、160 μg/L、400 μg/L、800 μg/L，按1.5节所述的色谱-质谱条件进行测定，绘制标准工作曲线。结果显示，7种甜味剂在所配制的浓度范围内，所有分析物的质量浓度x(ng/mL)和响应值y之间线性相关系数为0.999；以性噪比为3确定检出限，性噪比为10确定定量限，安赛蜜、糖精钠、甜蜜素和阿力甜检出限是10 μg/L、定量限是20 μg/L；阿斯巴甜、纽甜检出限是50 μg/L、定量限是100 μg/L；三氯蔗糖检出限是40 μg/L、定量限是80 μg/L。

2.3 精密度和回收率

精密度和回收率参照孙棣等[23]的方法，采用在空白样品中添加标准溶液的方法，选择常见的浓香型和兼香型两个不同香型白酒酒样及乙醇进行7种甜味剂的检测试验，成品白酒1、白酒2和乙醇3的三氯蔗糖含量均为未检出，并向两个样品中分别添加50 μg/L、100 μg/L浓度水平的甜味剂进行回收率实验，重复测定2次。共6组平行，12次检测，结果表明，在重复性条件下获得的两次独立测定结果的相对偏差小于2%，且回收率均在85%～105%范围内，所以该方法的精密度和回收率均符合相关标准要求。

3 结论

本研究利用液相色谱-质谱联用仪分析了白酒中7种甜味剂化合物的分子信息，利用多反应监测模式的液相色谱-质谱联用仪技术，建立了一个快速、稳定、灵敏的可定性定量甜味剂的方法。该方法可在14 min内完成，其检测范围内线性良好（r=0.999）；安赛蜜、糖精钠、甜蜜素和阿力甜检出限是10 μg/L、定量限是20 μg/L；阿斯巴甜、纽甜检出限是50 μg/L、定量限是100 μg/L；三氯蔗糖检出限是40 μg/L、定量限是80 μg/L；精密度＜2%；回收率＞85%；且与国标中的检测方法相比检出限更低，能更加有效的监控白酒中甜味剂的含量，综上所述该方法可以对甜味剂进行实际的定性定量检测。