巨噬细胞移动抑制因子基因多态性与子宫内膜异位症的相关性研究

谷杭芝 林蒙蒙 林蓉蓉 戴张波 胡燕

子宫内膜异位症是一种常见的妇科疾病，以宫腔以 外部位（卵巢、大网膜、子宫直肠陷凹、腹壁、肺等）的活性子宫内膜细胞增殖、浸润为特点，引起顽固性、进展性、慢性盆腔疼痛，可导致不孕、月经异常等。子宫内膜异位症虽然是一种良性疾病，但也存在恶变的风险[1]。育龄期妇女子宫内膜异位症发病率接近5%～10%，而近年来卵巢型子宫内膜异位症发病率有明显上升趋势。手术是治疗子宫内膜异位症的主要手段，但复发率高，严重影响育龄妇女的身心健康。巨噬细胞移动抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）是一种可溶性细胞因子，其在子宫内膜异位症患者的腹腔液、血清、异位内膜组织中均呈高表达[2-4]。本研究采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析（polymorphism chain reaction and restriction fragment length polymorphism analysis，PCR-RFLP）技术对MIF基因多态性进行分析，探讨其与子宫内膜异位症遗传易感性的关系，以期为子宫内膜异位症的发生机制及早期诊断提供依据。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2014年3月至2015年7月在本院妇科接受腹腔镜手术的卵巢型子宫内膜异位症患者150例作为病例组，术后标本均经病理学检查证实为子宫内膜异位症，年龄 21～46 岁，中位年龄 35（26，37）岁。选取同期本院健康体检者或因其他原因进行腹腔镜手术的患者150例作为对照组，通过询问既往史结合相关化验检查后排除子宫内膜异位症，年龄20～50岁，中位年龄29（25，36）岁。两组受试者年龄比较差异无统计学意义（P＞0.05），彼此之间无血缘关系，无妇科良、恶性肿瘤，无糖尿病、甲状腺功能异常等内分泌疾病，家族史中无遗传病，无肝炎、结核等感染性疾病，无类风湿性关节炎及其他自身免疫性疾病，近期未服用过激素类药物。本研究经医院伦理委员会批准和患者本人或其家属同意。

1.2 试剂与仪器 血液基因组DNA提取试剂盒、2×Taq PCR MasterMix、50bp DNA ladder、100bp DNA ladder、DNA loading buffer购自天根生化科技（北京）有限公司，限制性内切酶 AluⅠ、HaeⅢ、HpaⅡ购自 NEB（北京）有限公司，紫外分光光度计购自美国Thermo公司，电泳仪购自北京百晶生物技术有限公司，PCR扩增仪购自德国Mastercycler Gradient Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 基因组DNA提取 无菌操作下采集外周静脉血至少5ml，加入内置有0.85ml枸橼酸钠的试管中，混匀，放置于4℃冰箱保存备用（1周内检测）。采用血液基因组DNA提取试剂盒提取基因组NDA。

1.3.2 引物设计 搜索NCBI网站，获取人MIF基因的序列及 MIF-rs4822446 A/G、rs4822443 G/A、rs2012133 G/C位点序列。将MIF基因的序列导入Primer Premier 5软件中，使用Primer功能设计位于各基因位点上下游的引物序列，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，见表1。

表1 各位点引物序列

1.3.3 基因多态性检测 采用PCR-RFLP技术检测MIF-rs4822446 A/G、rs4822443 G/A、rs2012133 G/C 位点基因多态性。PCR反应体积为20μl体系，其中模板1μg，上游引物 1μl，下游引物 1μl，2×Taq PCR Master－Mix 10μl，双蒸水补足至 20μl。酶切体系为：PCR 扩增产物 2.5μl、10×Buffer 1μl、三蒸水 6.3μl、限制性内切酶0.2μl，恒温水浴4h。将酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，电脑成像系统成像分析。各位点限制性内切酶及其酶切产物长度见表2。

表2 各位点限制性内切酶及其酶切产物长度

1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件。计量资料以M（P25，P75）表示，组间比较采用Wilcoxon符号秩和检验；计数资料组间比较采用χ2检验；对照组各位点基因型频率的观察值与预期值行Hardy-Weinberg平衡检验。采用logistic回归分析计算等位基因和基因型的OR值和95%CI。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对照组Hardy-Weinberg平衡检验 对照组MIF-rs4822446 A/G、rs4822443 G/A、rs2012133 G/C 位点中基因型频率观察值与预期值间均符合Hardy-Weinberg平衡（均P＞0.05），表明本实验对照组资料具有群体代表性。

2.2 酶切结果 MIF-rs4822446 A/G位点经特异引物进行PCR后得到326bp大小的DNA双链，经AluⅠ酶切后，GG型可见1条326bp大小的条带，AA型可见1条200bp和1条126bp大小的条带，GA型同时可见上述3条条带，见图1。MIF-rs4822443 G/A位点经特异引物进行PCR后得到326bp大小的DNA双链，经HaeⅢ酶切后，AA型可见1条326bp大小的条带；GG型被酶切成1条298bp和1条38bp大小的条带，而38bp大小的条带较小，因此在电泳图上GG型仅见到1条298bp大小的条带；GA型可见1条326bp和1条298bp大小的条带，见图2。MIF-rs2012133 G/C位点经特异引物进行PCR后得到793bp大小的DNA双链，经HpaⅡ酶切后，CC型可见1条209bp和1条584bp大小的条带，GG型仅见1条793bp大小的条带，CG型同时可见上述3条条带，见图3。

图1 MIF-rs4822446 A/G位点酶切产物电泳图（1为GG型；2为GA型；3为AA型）

图2 MIF-rs4822443 G/A位点酶切产物电泳图（1为GG型；2为GA型；3为AA型）

图3 MIF-rs2012133 G/C位点酶切产物电泳图（1为CC型；2为CG型；3为GG型）

2.3 两组多态性位点等位基因、基因型频率分布 两组受试者MIF-rs4822446 A/G位点的等位基因和基因型频率比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。两组受试者MIF-rs4822443 G/A位点的等位基因和基因频率比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），其中携带A等位基因的妇女患子宫内膜异位症的风险较携带G等位基因的妇女高（OR=1.145，95%CI：1.053～1.246，P＜0.05）。两组受试者MIF-rs2012133 G/C位点的等位基因和基因频率比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），其中携带C等位基因的妇女患子宫内膜异位症的风险较携带G等位基因的妇女高（OR=1.208，95%CI：1.038～1.407，P＜0.05），见表 3。

表3 两组多态性位点等位基因和基因型频率分布比较[例（%）]

3 讨论

子宫内膜异位症目前最经典的病因学说就是Sampson提出的经血逆流学说[5]，而在实际的临床观察中发现，接近90%的育龄期妇女都会出现经血逆流，而只有10%会发展成子宫内膜异位症[6]。子宫内膜异位症是一种多基因遗传疾病，携带突变基因的患者子宫内膜细胞更具有黏附和宫外生长的活性[7]。目前有较多研究将关注点聚焦于MIF上，其在子宫内膜异位症发病中作用的研究已日益受到重视。人的MIF基因长度＜1kb，位于22号染色体长臂（2Zql1.2）的保守区内，由3个外显子和2个内含子组成。MIF含有115个氨基酸残基，相对分子质量约为12.5kDa[8]。国内外许多研究表明MIF在子宫内膜异位症患者的腹腔液、血清、异位内膜组织中均呈高表达[2-4]。李建等[9]研究也证实以上观点，并提出血清MIF水平在诊断子宫内膜异位症中具有一定价值，与糖类抗原125联合检测可提高子宫内膜异位症临床诊断的特异度，有助于疾病的鉴别诊断。

目前MIF基因见报道较多的有4个多态性位点，它们分别位于启动子区+656 C/G、+254 T/C、-173 G/C的3个单核苷酸多态性位点和-794的CATTn（n=5～8）微卫星多态性位点，研究表明MIF基因多态性与多种肿瘤的发病风险相关。有关MIF基因多态性与子宫内膜异位症的关系研究报道较少。王春平等[10]研究发现MIF基因启动子区-794 CATT微卫星多态性与广东汉族人群子宫内膜异位症的遗传易感性相关，且CATT（5/5）基因型及CATT（5）等位基因型可能是其易感基因型。于雅等[11]研究发现MIF基因启动子区+254 T/C位点多态性与子宫内膜异位症发生的易感性有关，而C等位基因可能是其发生的遗传易感标志。石瑾秋等[12]研究发现MIF基因启动子区-173位点多态性与湖南汉族人群子宫内膜异位症的遗传易感性相关，其CC基因型可能是其易感基因。以上研究均提示MIF基因多态性与子宫内膜异位症的遗传易感性有关。然而不同研究者得出不同的基因多态性位点均可能是子宫内膜异位症的易感基因，为进一步补充研究MIF基因多态性与子宫内膜异位症的遗传易感性关系，本研究从MIF-rs4822446 A/G、rs4822443 G/A、rs2012133 G/C 3个位点的多态性出发，通过PCR-RFLP技术发现MIF-rs4822443 G/A和MIF-rs2012133 G/C位点多态性与子宫内膜异位症的发病风险有关，而MIF-rs4822446 A/G位点多态性与子宫内膜异位症的发病风险无关。MIF-rs4822446 A/G位点A等位基因可能不是子宫内膜异位症的易感基因。MIF-rs4822443 G/A位点携带有A等位基因的妇女患有子宫内膜异位症的风险是携带G等位基因妇女的1.145倍。MIF-rs2012133 G/C位点携带有C等位基因的妇女患有子宫内膜异位症的风险是携带G等位基因妇女的1.208倍。

综上所述，本研究证实MIF-rs4822443G/A、rs2012133 G/C位点多态性与子宫内膜异位症遗传易感性有关，为临床筛选高风险妇女提供了检测依据。MIF-rs4822443 G/A位点携带有A等位基因和MIF-rs2012133 G/C位点携带有C等位基因的妇女MIF基因表达是否异常，是否与子宫内膜异位症的发病机制有关，有待进一步研究证实。