卵巢早衰卵泡膜功能的研究进展

张宇驰 盛 波 赵 聪 历 凯 郑 义 葛鹏玲

卵泡膜(follicular theca)是一层围绕颗粒细胞的结缔组织，由膜内腔和膜外腔组成，膜内腔含有分泌细胞，膜外腔由成纤维细胞组成。膜内腔和膜外腔均含有血管组织、免疫细胞和基质因子。卵泡膜为颗粒细胞层、卵丘细胞和卵母细胞提供营养。故卵泡膜不仅对维持卵泡结构的完整性至关重要，而且能产生关键的内分泌调节因子，如雄激素(包括睾酮和二氢睾酮)以及生长调节因子(包括骨形态发生蛋白和转化生长因子β)[1]。因此，研究卵泡膜功能对卵巢疾病的影响至关重要。近年来，新的分子细胞学方法以及老鼠模型已揭示卵泡膜对卵泡生长的影响以及对卵巢早衰(POF)疾病的影响。本文将对卵泡膜功能与POF疾病的最新研究进展进行综述。

一、卵泡膜功能的研究

1.卵泡膜形成的研究概况：1996年，Dong等[2]首次报道卵母细胞中的生长分化因子9(GDF9)参与调节卵泡膜形成，研究结果显示，在卵母细胞缺失GDF9的突变小鼠中卵巢功能被破坏。该研究首先在缺失GDF9的小鼠中发现小鼠卵泡停留在原始卵泡阶段，卵泡膜层不能发育。随后，在含有GDF9突变的绵羊和人类中观察到卵泡发育停滞[1]。以上研究结果首次证实从卵母细胞调节卵泡膜细胞层的功能和形成[2]。然而，GDF9是如何直接或间接介导该过程的机制尚不清楚。目前，有研究表明，GDF9可能是通过激活Hedgehog(HH)信号通路以及诱导BMP信号的抑制剂Gremlin介导卵泡膜形成过程[3]。此外，更有最新研究指出，原始卵泡和GDF9的表达受卵母细胞中特定因子的调节，这些因子包括FIGLA、LHX8、NOBOX、SOHLH1和SOHLH2以及NOTCH信号通路的组成部分JAG1和JAG2[4,5]。

Wijgerde等[6]的研究表明，在小鼠和牛卵巢中HH信号通路成分的表达可能影响局部细胞模式，该途径的配体是Desert hedgehog(DHH)和Indian hedgehog(IHH)而非Sonic hedgehog(SHH)，并在生长卵泡的颗粒细胞中选择性表达，同时激活HH细胞表面跨膜受体PATCHED1(PTCH1)和PATCHED2(PTCH2)，PTCH1、PTCH2存在于卵泡膜内膜、间质、成纤维细胞和血管周细胞中[7]。PTCH1/2的激活释放抑制PTCH1/2的G蛋白样受体Smoothened(SMO)从而导致下游转录因子GLI1和GLI2的激活，已有研究指出，GLI1和GLI2是膜前体细胞的潜在标志物[3]。SMO的激活还可以诱导抑制因子(PTCH2)和Hedgehog相互作用蛋白(HHIP)在卵泡内提供自分泌负调控作用[7]。因此，HH信号在局部水平被受到严格控制。更有研究显示，GLI1也是人睾丸间质前体细胞的标志物[8]。

最新对AMHR2-Cre小鼠研究中表明[6]：①SMO的过度激活导致HHIP被诱导，有力地证明SMO的激活能显著诱导HH信号的负调控作用；②类固醇生成基因表达升高，包括通常在卵泡膜细胞中表达的基因(Cyp11a1和Cyp17a1)；③SMO的过度激活也导致生长卵泡膜中血管周围平滑肌细胞的缺失。该研究团队还发现，小鼠早在出生后第8天就明显缺乏α-平滑肌肌动蛋白(aSMA)，在整个毛囊发育过程中持续存在，并与排卵缺陷有关[9]。由此可知，胚胎卵巢中SMO的过度激活似乎增强了卵泡膜(和颗粒)的类固醇内分泌功能，但抑制平滑肌细胞的功能。

更有研究表明，卵母细胞衍生因子GDF9调节颗粒细胞中DHH和IHH的表达，从而为GDF9的缺失扰乱卵泡膜细胞的募集、增殖、类固醇生成进而影响卵泡生长提供了一个潜在的解释[3]。

2.卵泡膜细胞的功能：研究显示，类固醇生成因子1(SF-1)调节性腺和肾上腺中的类固醇生成基因[3]。该研究表明SF-1在卵泡膜的内分泌细胞中具有重要的调控作用，SF-1敲除小鼠主要表现为不孕，性腺、垂体促性腺激素和肾上腺缺失。基于该项研究得出，DHH和IHH参与调节卵泡膜上的内分泌细胞包括肾上腺、卵泡膜细胞和Leydig细胞中的SF-1和类固醇生成酶Cyp11a1的表达来调节类固醇分化和合成。同时该实验还发现AMHR2-Cre小鼠中SMO过表达使HH信号激活，从而导致出生第2天小鼠的卵巢中肾上腺样细胞的Shh、Star和Cyp21a1表达出现异常，但不会对成年小鼠卵巢的类固醇合成有影响[6]。另一项研究表明，通过SF-1/Cre 途径激活HH信号，导致胎鼠卵巢Leydig细胞表现异常及假两性的畸形[10]。以上结果表明，卵泡膜细胞中HH信号的激活对类固醇合成的影响并非一成不变，它具有阶段性和环境特异性。

Lee等的研究表明，当SF-1基因中的类泛素化位点(K119、K194)突变为精氨酸(K119R、K194R)时，在小鼠胚胎的睾丸和肾上腺中会出现HH信号的异常激活。具体地说，该研究结果显示，诱导小鼠睾丸中通常非表达的SHH，将导致胚胎睾丸中特异性肾上腺基因(Akr1b7和Cyp21a1)和胚胎肾上腺中特异性睾丸基因(Sox9和Amhr2)的表达。同时，突变的胚胎睾丸中的Leydig细胞出现高表达的特异性基因(Lhcgr、Star、Cyp17a1和Insl3)和睾酮。致使睾丸发育异常，成年雄性小鼠不孕。尽管胚胎卵巢的类泛素化SF-1无显著表达，并且在同一发育阶段似乎不受突变型非类泛素化SF-1的影响，但雌性小鼠最终会表现不孕。如前所述，在AMHR2-Cre的小鼠胚胎卵巢中，SHH和CYP21A1被SMO过表达而激活，进一步表明胚胎性腺中内分泌前体细胞的重要性[6]。因此，有研究预测，在SF-1突变的卵巢细胞中SHH的异常表达将可能影响卵泡膜细胞基因的表达和后期发育的功能。

值得注意的是SMO、PTCH1和GLI1在颗粒细胞中也有表达。尽管在颗粒细胞中有HH信号在卵泡发育过程中的作用研究，但尚未被彻底阐明。根据颗粒细胞中HH信号通路成分水平的增加致使Smad1/5和BMPR1的缺失，可得出在颗粒细胞中BMPR1的活性被抑制与HH信号通路有关。更有研究指出，在Foxl2敲除小鼠中DHH mRNA表达明显增加HH信号通路，Foxl2是一个关键的颗粒细胞命运决定因素，推测HH信号可能被Foxl2调控在颗粒细胞中。

二、卵巢早衰卵泡膜的功能变化

1. 卵泡膜GDF9表达异常导致卵巢早衰：尽管大多数卵巢早衰(POF)的病因仍然是特发性的和未知的，但很明显，胚胎期和出生后的卵泡膜功能的破坏会导致异常的卵泡形成和生长。如前所述，小鼠卵母细胞衍生因子GDF9的缺失阻止了卵泡膜细胞层的组织，导致卵泡生长停滞、POF和不孕[2]。已有报道指出，人类GDF9基因的突变与POF相关，该研究表明GDF9对女性卵巢功能至关重要。根据GDF9在卵泡发育早期卵泡膜细胞募集和功能中的关键作用，可以通过调节GDF9表达水平或是使GDF9活性因子被破坏亦或发生基因突变都将会导致POF的发生。GDF9基因异常导致POF的原因之一是已有研究表明，在卵母细胞中表达的新生卵巢同源(NOBOX)蛋白被敲除后，GDF9的表达被抑制导致卵泡生长停滞[4]。此外，GDF9基因是NOBOX的直接靶基因。GDF9启动子区域与NOBOX的结合位点相结合，从而使GDF9基因上游改变，导致GDF9的异常表达，最终POF发生[11]。

2. 卵泡膜基因突变导致POF：BMP15和GDF9一样，在卵母细胞中表达，并影响卵泡发育[12]。然而，与GDF9的功能不同，BMP15的缺失可增加生育能力，BMP15基因是GDF9异二聚体通过BMPR2和ALK6的共同受体组成的独特受体复合物，并表现出更强的活性[12]。已有研究显示，BMP15的突变与POF有关，BMP15启动子的一个突变似乎增加了由垂体同源体1(PITX1)介导的BMP15转录，PITX1是一种在卵母细胞中表达的转录因子。BMP15的过表达降低了颗粒细胞促卵泡生长激素受体(FSHR)的表达，导致卵泡消亡[13]。但BMP15和BMPR2的突变是否与卵泡膜功能被破坏有关尚待研究确定。

最近全外显子测序在POF家族中的应用已经确定了一系列的新基因，这些新基因也可能像GDF9和NOBOX一样，涉及卵母细胞的丢失或改变卵泡膜功能以及随后的卵泡消亡。许多新发现的基因与减数分裂和DNA损伤反应有关。与减数分裂功能障碍相关的新基因包括STAG3、HFM1、MCM8、SGO2和NUP107[14～18]。笔者推测未来几年，将会发现更多的新基因。

DNA损伤反应基因突变导致染色体不稳定也将最终导致POF。这些基因包括NBN、WRN和RECQ14基因的突变[19～21]。但上述基因在卵泡膜细胞生物学中的作用尚无研究报道，但它们可能会对卵泡膜功能产生有害影响，因为如上所述，卵母细胞中表达的任何基因的破坏都可能导致卵泡膜细胞的功能异常，从而导致卵泡发育障碍及卵巢早衰疾病的发生。

最新研究表明，卵巢细胞中IHH和DHH的破坏或SMO的过度表达与卵泡膜细胞发育和功能异常有关。然而，Tsuji等[22]研究表明在女性中，HH信号通路基因的突变与POF可能无关。尽管许多基因在小鼠体内的破坏已经揭示了它们在早期卵泡发育和生育中的关键作用，但人类的类似基因突变尚未观察到(上文所述的除外)。另有研究指出，LH受体上LHCGR和INSL3的突变会影响卵泡膜细胞的功能和生育能力。ADAMTS19和IGFR2的基因突变与POF有关。由于ADAMTS19只在胚胎卵巢表达，而不在睾丸中表达，因此Adamts19将受到更多关注。

三、展 望

卵巢早衰(POF)是导致女性不孕的重要原因之一，研究显示，POF在育龄妇女中的发生率为1%～3%，其伴随出现的围绝经期生理和心理变化以及因性激素缺乏而引起的神经、代谢、心血管系统异常和骨质疏松等表现严重影响女性的正常生活和工作[23]。近年来，该疾病趋近于年轻化并且发生率呈逐年上升趋势，患者的发病原因不仅与遗传、免疫等因素有关，有些药物或卵巢手术也可能会引起POF的发生，甚至工作压力大、长期焦虑或抑郁等会给女性精神上造成极大的危害，以致出现月经不调、内分泌紊乱等症状，从而影响到卵巢的正常功能。

卵巢早衰发病机制十分复杂，涉及卵巢中基因、激素水平及信号通路多种因素，引起卵巢功能障碍。近年来关于卵巢卵泡膜功能异常导致POF的研究取得一定进展。卵泡膜是一个复杂的动态组织，由膜内分泌细胞、成纤维细胞、血管成分、免疫细胞以及细胞外基质组成。这些细胞和基质分子以及垂体通过提供激素、营养和结构来调节毛囊的生长；反过来，它们又受到来自颗粒细胞和卵母细胞的因子的调节[24]。因此，关注卵巢卵泡膜功能变化对卵巢早衰等性腺疾病的发病机制研究尤为重要。目前卵巢早衰卵泡膜功能研究仍较少，需开展更深入的研究与探索。