SAM系小鼠生命进程和生存质量评价以及寿命分析

樊 蕊 杜 倩 郝云涛 徐美虹 李 勇

随着生活水平和医疗保健技术的不断提高和完善，人类的平均寿命逐渐延长，中国已迈入了老龄社会。老年人的身心健康和生活质量引起了科学界的高度关注。为此，如何对衰老进行客观量化的评价，进而据此采取有效的措施延缓衰老，提高生存质量，已成为当今世界性的重大医学课题。

衰老是人口老龄化面临的首要问题。衰老是一种正常而复杂的生物学过程，是所有生物的共同特征，衰老表现为组织和功能衰退，适应性和抵抗力减退。为了充分深入地研究衰老机制以及延缓衰老的方法，衰老相关疾病动物模型的研究有着十分重要的价值。目前建立的大鼠、小鼠等啮齿类动物的衰老模型包括自然衰老模型，D-半乳糖所致衰老模型，去胸腺衰老模型，臭氧损伤衰老模型，SAMP系小鼠衰老模型等，且各模型均有其优势及不足[1～4]。

快速老化小鼠(senescence accelerated mouse, SAM)是日本京都大学Takeda教授经过20多年精心培育得到的一种近交系衰老模型鼠，包括SAMP(senescence accelerated prone mouse, SAMP)和SAMR(senescence accelerated resistant mouse, SAMR)两种品系[5]。SAMP在进入成熟期(约4～6月龄)后迅速出现行动反应迟缓、被毛光泽减退、脱毛、皮肤溃疡、眼周损害、角膜溃疡、白内障、脊柱弯曲等老化特征，SAMR表现为正常衰老，一般作为SAMP的正常对照。SAMP8是SAMP系中的一个亚系，主要以学习记忆能力障碍为老化特征，其寿命约为12.1个月，是目前比较理想的自然衰老模型小鼠[6,7]。

目前学者对于SAMP8小鼠的研究多集中在脑退化方面，而对于其衰老的评价以及老龄小鼠的生存质量并未见报道，同时对于该模型小鼠的实际寿命也未见具体报道[8,9]。在对衰老的研究中，衰老的评价是衰老研究领域中的关键问题和难点问题。本研究对SAM系小鼠喂养终生，对其衰老的进程以及生存质量予以探析，对于其寿命予以统计，以期对充分恰当的应用该模型小鼠提供理论依据，同时对衰老的评价提供思路和参考。

材料与方法

1.材料：4月龄SPF级雄性SAMP8小鼠20只，相同月龄的SAMR1小鼠25只，由北京大学医学部实验动物中心提供,实验动物生产许可证号为SCXK(京)2016- 0010，屏障环境动物房,实验动物使用许可证号为SYXK(京)2016-0041，单笼单只饲养，饲养环境温度21～23℃，湿度50%～60%。喂饲普通小鼠生长饲料，所有动物自由饮水进食。动物喂养及实验严格按照 《北京市实验动物管理条例》执行，并经过北京大学医学部伦理学委员会审核通过 (批准号: LA2017017)。

2.动物一般状态观察及体格指标测定：每周观测并记录动物的活动度、毛发光泽、摄食量、饮水量、体质量。

3.脏器指数：各组小鼠饲养临近至寿命终点时，小鼠称重后脱颈椎处死，无菌快速剥离腓肠肌及其他肌肉，记录腓肠肌质量、其他肌肉质量。分别称重小鼠的心脏、肝脏、肾脏、脾脏、胸腺，计算脏器指数。脏器指数(g/kg)=脏器重(g)/体质量(kg)。

4.爬网实验：分别在小鼠16周龄、45周龄和84周龄时，将小鼠放在垂直的金属网上，金属网(长度1.5m，宽带0.5m)置于距地面0.5m处，记录每只小鼠在金属网上停留时间。为了表征小鼠的运动障碍，根据爬网实验中爬网的时间进行转化并进行评分，分值赋值如下：当爬网时间≤3s，运动障碍评分3分；当爬网时间3.1～5.0s，运动障碍评分2分；当爬网时间5.1～7.0s，运动障碍评分为1分；当爬网时间≥7.1s，运动障碍评分为0分。

5.老化度评分：采用日本京都大学竹田俊男和细川昌则教授制定的老化度评分标准，并结合小鼠的运动能力进行适当修改，分别将小鼠外在形体及行为的老化改变从外观衰老(光泽及粗糙程度、脱毛程度)、组织病变(皮肤溃病、眼周损害、白内障、阴茎、肿瘤、断尾)、体态衰老(脊柱后凸、颤抖)、反应退化(反应性、被动逃避)及运动障碍(爬网能力)13项进行综合评价，再根据严重程度不同，将每项指标标定分值，客观进行评分，分值越高则老化度越高。[10]

结 果

1.SAM小鼠体质量变化：随着SAM小鼠周龄的增加，其体质量呈现先增加后降低的趋势，SAMP8小鼠体质量的变化大体趋势与SAMR1小鼠相似，但是在整个生命周期中，整体体质量均低于SAMR1小鼠。SAMR1小鼠在30周龄前，其体质量呈现增加的趋势(体质量增加期Ⅰ)，在周龄达到35周后，体质量出现小幅度降低后又出现明显的增加(体质量增加期Ⅱ)，SAMR1小鼠在45周龄时，体质量达到最大为41g，45周龄后体质量持续下降(体质量下降期Ⅰ)，在55～70周，体质量基本恒定(体质量恒定期)，当体质量经历小幅度增加后(体质量增加期Ⅲ)，74周后体质量急剧下降(体质量下降期Ⅱ)。而在SAMR1小鼠体质量增加期Ⅰ这段时间，SAMP8小鼠体质量反复变化，且随着周龄增加，SAMP8并未出现体质量恒定期，反而在此期间，SAMP8小鼠体质量小幅度降低，详见图1。

图1 SAMR1和SAMP8小鼠生命周期体质量的变化

2.SAM小鼠摄食量、饮水量的变化：从整体趋势看，SAMP8小鼠摄食量高于SAMR1小鼠。SAM小鼠在刚进入成熟期(16周)后，进食量急剧增加，当达到20周龄后，SAM小鼠进食量降低，当SAMR1和SAMP8小鼠周龄达到30周后，其进食量又一次急速增加，均在34周达到其最大进食量，分别为52克/周，45.5克/周，随后其摄食量出现下降，SAMR1小鼠达到45周后，摄食量出现小幅度增加后极速降低，当周龄54周时降至最低摄食量25.7克/周，随后其摄食量再一次增加至73周，而SAMP8小鼠在34～47周期间，摄食量持续降低，随后其摄食量缓慢增加并保持恒定至73周，而在此期间，SAMP8小鼠摄食量高于SAMR1小鼠，当SAMR1小鼠周龄高于74周后，其摄食量降低后有小幅度增加，而74周后 SAMP8小鼠摄食量持续下降。

从整体趋势看，在48周前，SAMP8小鼠饮水量低于SAMR1，而随着周龄增加，SAMP8饮水量高于SAMR1。SAM小鼠饮水量变化分为8个时期，依次为：饮水量增加期Ⅰ(SAM小鼠，16～20周龄)；饮水量降低期Ⅰ(SAM小鼠，20～33周龄)；饮水量增加期Ⅱ(SAMR1小鼠，33～44周龄；SAMP8小鼠，33～37周龄)；饮水量降低期Ⅱ (SAMR1小鼠，45～49周龄；SAMP8小鼠，37～49周龄)；饮水量增加期Ⅲ(SAM小鼠，49～53周龄)；饮水量恒定期(SAMP8小鼠，53～65周龄；SAMR1小鼠，53～57周龄)；饮水量降低期 Ⅲ(SAMR1小鼠，57～74周龄； SAMP8小鼠，65～75周龄)，详见图2。

图2 SAMR1和SAMP8小鼠生命周期摄食量、饮水量的变化A.摄食量；B.饮水量

表1 临近寿命终点SAMR1和SAMP8小鼠脏器指数

3.SAM小鼠脏器指数：临近寿命终点的SAMP8小鼠的心脏指数、肝脏指数大于SAMR1小鼠，但差异无统计学意义(P>0.05)，而SAMP8小鼠脾脏指数、胸腺指数和肾脏指数小于SAMR1小鼠，其中肾脏指数差异有统计学意义(P<0.05)。

4. SAM小鼠骨骼肌含量比较：临近寿命终点的SAMP8小鼠的腓肠肌和骨骼肌的质量均小于SAMR1小鼠，但差异无统计学意义(P>0.05)，成熟期SAMP8小鼠，后肢骨骼肌饱满，而临近寿命终点的SAMP8小鼠的后肢肌肉萎缩，并且可以看到脂肪浸润，与同周龄的SAMR1小鼠的骨骼肌呈现鲜明的对比(图3)。

5.SAM小鼠衰老评分：老化度评分是从外在形体及行为变化来评定机体的老化程度，反映了机体的衰老征象。从图4中可以看出，14周龄的SAMP8小鼠仅仅表现为脱毛和毛色失去光泽，而在组织病变、体态衰老、反应退化和运动障碍方面并无相应的表现。而45周龄的SAM小鼠，SAMP8小鼠在外观衰老、体态衰老、反应退化和运动障碍方面得分显著高于SAMR1小鼠。45周龄的SAMP8和SAMR1小鼠仅在组织病变方面未表现出轻微程度的病变，两者得分差别微小。临近寿命终点的SAM小鼠，其运动障碍、外观衰老、体态衰老和反应退化方面的表现显著差于45周龄SAM小鼠，且与同周龄的SAMR1小鼠比较，SAMP8小鼠在外观衰老、运动障碍以及体态衰老方面的程度更高。

图3 SAMR1和SAMP8 临近寿命终点骨骼肌含量

图4 SAM小鼠不同时期的衰老评分

6.SAM小鼠寿命分析：由图5可知，SAMR1小鼠在55～56周龄时，开始出现死亡，此时段死亡比例为5%，但SAMP8小鼠在34～35周龄，便开始出现死亡，此时段死亡比例为7%。在整个生命进程中，SAMP8小鼠在40～60周，其生存率急速下降，而SAMR1小鼠在60～67周，73～80周出现两个死亡率急速上升期。通过分析，SAMR1小鼠中位数生存时间为79周，饲养52周(1年)，其累计生存比例为1，饲养60周后，其累计生存比例为0.9，而SAMP8小鼠中位数生存时间为70周，饲养52周(1年)，其累计生存比例为0.73，饲养60周后，其累计生存比例为0.53。通过生存函数曲线可以看出整体趋势，即SAMP8较SAMR1小鼠的生存率下降更快，通过LogRank(Mantel-COX,P=0.5)，Breslow(GeneralizedWilcoxon,P<0.05)，通过Tarone-Ware(P<0.05)分析，可知SAMR1小鼠的生存率显著高于SAMP8小鼠。

图5 SAM小鼠累积生存函数图

讨 论

机体功能下降和紊乱，同时伴随着生理学、解剖学方面的变化和对体内外环境适应力和代偿力的减退，此综合现象称之为衰老。主要表现为机体学习记忆能力下降，脏器功能减退，皮肤弹性下降等。生存质量与多方面信息有关，目前人类健康相关的生存质量评价包括了生理健康、心理状态、独立能力、社会关系等方面，对于实验动物的生存质量研究多集中在疾病状态下的生存质量，多参考体质量、摄食量、肿瘤/疾病恶略程度、腓肠肌质量、自主活动能力以及生存期等方面，综合评价其生存质量，对于衰老动物的生存质量评价鲜有报道。参考疾病状态下实验动物的生存质量评价，本文提出了综合体质量、摄食量、内脏指数、骨骼肌质量、衰老评分以及寿命几方面，作为参考指标综合评价衰老SAM系小鼠生存质量，其中衰老评分体系是在参考日本京都大学竹田俊男和细川昌则教授制定的老化度评分标准，并结合小鼠的运动能力进行适当修改，其可以作为SAMP8小鼠衰老的标准评价指标，且具有SAMP8独特特征[10]。

动物衰老进程中的体质量下降是由于构成机体的主要物质如蛋白质等合成量降低，不足以补充其分解，因此造成结构物质不断损耗，细胞结构受到破坏。由图1可知，SAM小鼠体质量大体变化趋势为：在达到45周龄前，随着周龄增加，体质量基本呈现增加的趋势，其中SAMR1小鼠体质量持续增加而SAMP8小鼠体质量变化较为曲折。当SAM小鼠达到45周龄后，随着周龄增加体质量呈现下降趋势，SAMP8小鼠体质量的变化趋势与其摄食量变化的趋势大致相似，尤其是当SAMP8小鼠37～41周，其摄食量下降，体质量也呈现下降的趋势。在整个生命周期中，SAMR1小鼠的体质量始终高于SAMP8小鼠体质量。可见，同属SAMR1小鼠具有正常的衰老特征，其进入衰老的时间晚于同属的SAMP8小鼠。

衰老的因素很多，研究者认为免疫系统结构老化与功能下降是衰老的主要原因与标志。胸腺是免疫系统的中枢器官，对维持细胞免疫和调节免疫反应起重要的作用。其发育、退化具有显著的年龄特征。新生儿的胸腺仅为10～15g，而至青春期可达30～40g，此后开始退化，到老年期几乎全部被脂肪组织所替代[11]。因此，在机体衰老的进程中，胸腺功能的衰退最为明显，因此，胸腺衰老被看作是老化过程中最重要的标志之一[12]。研究表明，脾脏的代谢随年龄增长而减弱，因此，胸腺和脾脏的萎缩，代表机体免疫功能减弱，可加速衰老进程[11]。而肾脏是机体衰老过程中变化最为显著的器官之一，可作为表征衰老的指标之一。在本实验中，SAMP8小鼠胸腺、脾脏指数均低于SAMR1小鼠，但差异无统计学意义，提示两种小鼠胸腺和脾脏萎缩状况的差异并不明显。这可能是因为70周龄两种小鼠均步入衰老时期。而对于D-半乳糖结合辐射所致昆明小鼠的急性衰老模型中，其胸腺和脾脏指数显著降低，这有可能是取材测定时期(20周)并未进入昆明小鼠的老年期[13]。本实验发现SAMP8小鼠肾脏指数显著低于SAMR1小鼠(P<0.05)，这表明70周龄的SAMP8衰老程度较SAMR1小鼠更为明显。

随着年龄增加，骨骼肌中蛋白质合成量不足，细胞结构破坏后氧化磷酸化功能受损，ATP合成减少，导致体力下降。人体从成熟到衰老，骨骼肌质量的下降，肌力减退。到60～70岁，人体肌肉质量下降25%～30%，小鼠与大鼠肌肉质量下降10%～25%[14]。本实验中，与成熟的SAMP8小鼠后肢肌肉比较，70周龄的SAM小鼠后肢肌肉含量降低，并且同周龄的SAM小鼠，SAMP8小鼠肌肉质量明显低于SAMR1小鼠，并且可以清晰的看到，SAMP8小鼠后肢肌肉存在脂肪浸润的现象。在衰老过程中，肌肉之间脂肪和连接物质不断增多，肌纤维面积萎缩，而收缩物质，尤其是2型肌纤维显著减少，从而导致肌肉体积和重量随年龄性增加而降低[15]。

本实验中还对SAM小鼠的运动障碍的程度进行了评价，随着SAMP8小鼠进入成熟期，其爬网能力随着周龄的增加随之降低，其运动障碍程度明显高于同周龄的SAMR1小鼠。研究发现，由于在衰老过程中肌肉内部性质发生了变化，造成肌肉萎缩，肌肉力量下降，人类从30～80岁，肌肉力量下降30%～40%[16]。84周龄的SAM8小鼠运动障碍程度明显高于同周龄SAMR1小鼠，而成熟期的SAMP8小鼠未见明显的运动障碍，两者的后肢肌肉含量的差异可由图4清晰的看到。

本研究发现45周龄的SAM小鼠，SAMP8小鼠在外观衰老、体态衰老、反应退化和运动障碍的程度显著高于SAMR1小鼠，表明SAMP8小鼠在经过成熟期(4月龄)后进入快速衰老而出现明显的衰老现象，其现象与前期报道结果一致[17]。45周龄的SAM小鼠仅在组织病变方面，两者未表现出任何组织病变。随着饲养时间的延长，SAM小鼠衰老程度增加，当饲养至84周时，SAPM8小鼠SAPM8表现出明显的外观衰老、体态衰老和运动障碍。

有研究报道，SAMP8平均生存期为12～13个月，4～6月龄后开始出现衰老征象，故9月龄已进入老化阶段[18]。本研究发现，SAMP8小鼠在34～35周龄，便开始出现死亡，当进入 SAMP8小鼠在40～60周之间，其生存率急速下降，对比图1和图2，发现40～60周这段时间，小鼠摄食量和体质量也呈现下降的趋势，此时间段符合文献中报告的平均生存期限。本研究分析显示，SAMR1小鼠中位数生存时间为79周，而SAMP8小鼠中位数生存时间为70周，可见，本研究报道的SAMP8小鼠的中位数生存时间长于前期文献报道[19]。而本研究分析，SAMP8小鼠饲养52周(12个月)，其累计生存比例为0.73，饲养60周后，其累计生存比例为0.53。其最长寿命长于文献中报道的12～13个月。有研究报道，二甲双胍对延长SAMP8雄性小鼠的寿命起到积极的作用。通过中剂量组二甲双胍干预的SAMP8小鼠12月龄生存率达到70%，而在本实验中发现，即使不经过任何干预，自然生长的SAMP8小鼠12月龄的生存比例为0.73[20]。与自然衰老的ICR小鼠比较，其饲养26个月，其累计生存比例为0.50[20]。自然衰老的Wistar大鼠半数生存出现在 92.5周。可见，SAMP8小鼠作为研究衰老的模型鼠。

综合相关研究分析，SAMP8小鼠寿命的延长的机制值得进一步研究，并且将在后续实验中开展延长寿命的营养干预措施研究。