阿特拉津高效降解菌株DnL1-1发酵培养基的优化

李红梅，魏艳丽，扈进冬，杨凯，刘宝军，杨合同，BAZHANAU Dzmitry，李纪顺

(齐鲁工业大学(山东省科学院)，山东省科学院生态研究所,山东省应用微生物重点实验室，山东 济南 250103)

阿特拉津(2-氯-4-二乙胺基-6-异丙胺基-1,3,5-三嗪，Atrazine)是世界范围内广泛使用的三嗪类除草剂，主要应用于玉米、甘蔗、高粱田及草坪杂草的防除。因其溶淋性好、迁移率高、持效期长，已造成多个国家的土壤和地表、地下水污染[1]。土壤的物理及化学性质不同，阿特拉津在土壤中的半衰期从21天到一年不等，易对后茬敏感作物产生药害[2]。而且，阿特拉津还干扰人和动物的内分泌，具有潜在的生态风险[3-5]。因此，阿特拉津污染环境的生物修复成为人们关注的热点。

阿特拉津在环境中通过化学脱氯和微生物作用进行降解[6]，微生物修复是降低土壤中阿特拉津的主要途径，具有经济、高效、无二次污染等优点[7]。Zhang等[8]研究表明，降解菌DNS10能有效去除土壤中的阿特拉津，修复效果显著。因此，向阿特拉津污染土壤中施加降解菌的方法，能达到去除的目的。本课题组前期从山东省玉米田中分离到一株阿特拉津高效降解菌DnL1-1，经鉴定为产脲节杆菌(Arthrobacterureafaciens)[9]。为提高菌株DnL1-1的发酵水平，本文通过单因子筛选、正交试验对菌株的发酵培养基进行了优化，确定了最佳培养基配方，以期为其工业化生产及推广应用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

产脲节杆菌(A.ureafaciens)DnL1-1，系本实验室分离保存，菌株保藏号CGMCCNO. 9667。

1.2 培养基

TY培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物1 g/L，氯化钙0.2 g/L，pH 7.2；固体培养基添加1.0%的琼脂。

SMY培养基[10]：磷酸氢二钾0.5 g/L，硫酸镁0.2 g/L，氯化钠0.1 g/L，氯化钙0.02 g/L，柠檬酸三钠0.5 g/L，硫酸亚铁0.02 g/L，硫酸锌0.002 g/L，葡萄糖2 g/L，阿特拉津0.5 g/L，酵母提取物0.1 g/L。

发酵基础培养基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母提取物0.1 g/L， 磷酸氢二钾0.5 g/L，磷酸二氢钾0.25 g/L，硫酸镁0.1 g/L，氯化钙0.1 g/L。

1.3 培养方法

1.4 菌体测定方法

采用SMY平板活菌计数，每浓度重复3次。

1.5 发酵培养基的优化

在菌株发酵基础培养基的基础上，分别对碳源(葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、玉米粉，20g/L)、氮源(尿素、酵母、蛋白胨、牛肉浸粉、豆饼粉，15 g/L)、无机盐(磷酸氢二钾1 g/L、磷酸二氢钾0.5 g/L、氯化钙0.1 g/L、硫酸镁0.1 g/L)等进行了筛选，确定最佳碳氮源、无机盐及浓度。

1.6 正交试验

在单因素分析基础上，利用正交设计分析实验结果，确定最佳培养基配方。实验分别筛选发酵基础培养基中的最佳碳氮源及浓度，再结合 L18( 37) 正交试验对培养基中碳源、氮源、酵母提取物及无机盐进行优化。发酵结束后活菌计数，菌数最高的处理为最佳。

2 结果与分析

2.1 碳源的筛选

选用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、玉米粉、可溶性淀粉为碳源，培养36 h后进行平板活菌计数。图1、图2结果显示葡萄糖为最佳碳源，其对菌株的生长有很好的促进作用，且最佳浓度为20 g/L。

2.2 氮源的筛选

以等量氮源替换基础氮源，考查不同氮源对菌株生长的影响。如图3、图4所示，酵母粉做氮源，菌株的生物量最高；蛋白胨做唯一氮源时，菌体生长量下降。从以往发酵经验来看，酵母粉作为生长因子是发酵培养基中必不可少的成分，如图5所示，我们以蛋白胨作为氮源，同时添加少量酵母粉获得不错的生物量。综合考虑，以蛋白胨作为氮源，同时加入少量酵母粉为生长因子。

图1 不同碳源对菌体生长的影响Fig.1 Effect of different carbon sources on the DnL1-1 growth

图2 不同葡萄糖浓度对菌体生长的影响Fig.2 Effect of different glucose concentrations on the DnL1-1 growth

图3 不同氮源对菌体生长的影响Fig.3 Effect of different nitrogen sources on the DnL1-1 growth

图4 不同蛋白胨浓度对菌体生长的影响Fig.4 Effect of different peptone concentrations on the DnL1-1 growth

图5 蛋白胨+酵母粉组合对菌体生长的影响Fig.5 Effect of peptone + yeast powder combination on the DnL1-1 growth

2.3 正交试验

发酵培养基正交试验因素和水平设计见表1，所选7个因素为葡萄糖A、蛋白胨B、酵母提取物C、磷酸氢二钾D、磷酸二氢钾E、氯化钙F、硫酸镁G。

表1 发酵培养基正交试验因素和水平设计

表2 正交试验结果

3 讨论与结论

近年来，研究者主要着重于降解菌的生物特性、降解特性及机理等方面的研究[11-13]，但菌株用于土壤污染修复的研究报道较少，且都局限于室内盆栽实验[14]。本研究中的产脲节杆菌DnL1-1，能有效在作物根际定殖，且室内模拟实验对阿特拉津污染土壤的修复效果较好[15]，尤其是对低浓度污染土壤的修复效果显著，因此，该菌株具有良好的生产应用价值。

菌株的发酵水平是其应用的基础，发酵条件的优化可以提高发酵的产量，降低实际修复的成本。本研究经单因素试验发现，在碳源的选择上DnL1-1更适合在葡萄糖中生长，这与相关报道一致[16]，但也有些节杆菌在淀粉中生长更好[17]，这有可能是在节杆菌属中种的不同而导致最适碳源的差异。在氮源的选择上，酵母粉适合该菌株的生长，但考虑到生产成本，综合发酵基础培养基以蛋白胨为氮源添加少量酵母粉作为生长因子，也能达到很好的生长量。最终筛选出DnL1-1的培养基配方为：葡萄糖15.0g/L，蛋白胨7.5g/L，酵母提取物 0.50g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，氯化钙0.15g/L，硫酸镁0.15g/L。

产脲节杆菌DnL1-1优化后的培养基配方，发酵液菌体数量较优化前有了显著提高。本研究是在实验室摇瓶发酵条件下进行的，若要实现工业化生产，还需在发酵罐条件下进行发酵工艺参数及后处理工艺参数的优化实验，同时要进行相关剂型的研究开发，后续工作正在进行中。