木霉拌种剂对小麦根际土壤真菌群落多样性的影响

扈进冬，吴远征，魏艳丽，李红梅,辛相启，杨凯,李纪顺*

(1.齐鲁工业大学(山东省科学院)，山东省科学院生态研究所，山东 济南 250103；2. 山东省农业科学院植物保护研究所，山东 济南 250100)

根际土壤即植物根系周围受到根系生长影响的土壤部分，最早由德国微生物学家Lorenz Hiltner于1904首先提出，是由植物根部生态系统与土壤生态系统共同作用形成的交互区域[1]。在植物根际土壤中存在两大类的微生物，其中一类能促进植物生长，是对植物有益的微生物，可以通过营养竞争、拮抗作用和诱导系统抗性等机制抑制土壤中病原菌，进而促进植物生长[2]；另外一类微生物影响植物生长，是对植物有害的微生物，其积累常常会导致植株的大量死亡[3]。在这些有害的微生物所引起的植物病害中，大部分病害是由病原真菌侵染引起的，常常给农业生产造成巨大的经济损失[4]。

小麦根部真菌病害是严重危害小麦生产的一种常见性病害，杨韶勇等[5]报道小麦真菌病害有70种，其中土传病害比地上部的病害更难防控，如小麦纹枯病、根腐病等已经成为影响小麦产量的重要因素之一。目前，多采用化学药剂进行防治，但长期使用易产生药害，病原菌也产生抗药性，而且污染环境。通过使用根际有益微生物可以诱导植物抗性、增加根际土壤中的生物多样性，从而控制根际真菌病害，减少环境污染。木霉菌作为一种根际有益微生物，可以有效防治多种病原真菌引起的小麦病害[6-8]。为了解生防木霉对小麦发育期根际微生物群落的影响，本试验以哈茨木霉LTR-2为供试菌株拌种处理小麦，通过高通量测序技术解析了根际土壤真菌群落特征，以及其与木霉菌拌种之间的相关性，为利用木霉菌防治小麦真菌病害提供了重要的理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料与试验地概况

2017年10月于山东省科学院东区试验田中进行田间试验，试验点前茬作物为花生，地势平坦，灌溉条件良好，土壤为砂质壤土，有机质含量1.3%，pH 7.3，土壤肥力基本均匀一致。播种前施用硫酸钾复合肥(m(N)∶m(P)∶m(K)=15∶15∶15)750 kg/hm2，返青拔节期追施相同化肥150 kg/hm2。2017年10月16日播种，播种量112.5 kg/hm2。小麦品种为鲁原502，泰安登丰种业有限公司提供，试验所用LTR-2种衣剂(2×108cfu/g)为实验室制备，5%戊唑醇悬浮种衣剂为青岛翰生生物科技股份有限公司生产。

1.2 试验设计

试验采取随机区组排列，按药剂处理及空白对照共3个处理,每处理30 m2，3次重复，小区面积30 m2，试验地四周设保护区。土壤样品采集于2017年11月14日、12月15日、2018年3月15日、4月15日、5月15日分5次采样，每个小区随机取5个样点，每样点随机选取10株麦苗，挖出根系，用抖根法采集附着在根际表面的土壤，混匀后为该样点的根际土壤样品。每个处理的3个小区的根际土壤样品混合成1个样品，将土壤样品过20目细筛，冻存于-80 ℃冰箱中备用。

1.3 土壤微生物基因组DNA提取和PCR扩增

提取试剂盒为Omega土壤微生物DNA提取试剂盒，称取0.5 g -80 ℃保存的土壤样品，按试剂盒的试验步骤进行土壤微生物总DNA的提取，DNA样品于-20 ℃保存待用。

提取样品总DNA后，PCR所用的引物为带标签序列的Miseq测序平台的ITS3-4通用引物， ITS4F(TCCTCCGCTTATTGATATGC)和ITS3R(GCATCGATGAAGAACGCAGC)进行两轮扩增，第一次PCR反应体系：含2×Taq master Mix 15 μL，Bar-PCR primer F (10 μmol/L)1.0 μL，Primer R (10 μmol/L)引物1.0 μL，Genomic DNA 10～20 ng，双蒸水补足至体积30 μL。PCR反应条件：94 °C 3 min；94 °C 30 s，45 °C 20 s，72 °C 30 s，5个循环；94 °C 20 s，55 °C 20 s，72 °C 30 s，20个循环；72 °C 5 min，PCR结束后进行第二轮扩增。第二轮PCR扩增引入Illumina桥式PCR兼容引物，反应体系含2×Taq master Mix 15 μL，primer F(10 μmol/L) 1.0 μL，Primer R(10 μmol/L)1.0 μL，PCR 产物(上一轮)20 ng，双蒸水补足至体积30 μL。PCR反应条件：94 °C 3 min；94 °C 20 s，55 °C 20 s，72 °C 30 s，5个循环；72 °C 5 min。然后对其产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库，建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用Illumina MiSeq PE250进行测序，由上海生工生物工程股份有限公司完成Miseq测序。

1.4 高通量测序结果的数据处理及分析

Miseq测序完成后，采用软件cutadapt去除引物接头序列，再根据PE reads之间的overlap关系，使用PEAR将成对的reads序列进行序列拼接，Prinseq对各样本数据的质量进行质控过滤，使用Usearch去除预处理后序列中非扩增区域序列，而后对序列进行测序错误校正，并调用uchime进行嵌合体鉴定。随后，再将去除嵌合体的序列与数据库代表性序列进行blastn比对，低于阈值的比对结果认为是靶区域外序列，并剔除掉该部分序列，得到各样本有效数据。根据序列之间的相似性将序列分成不同的操作分类单元 (OTU)，在97%的相似水平下的OTU进行生物信息统计分析。在分析时将同一处理的5个不同发育时期的取样样品作为一个小组，木霉菌拌种处理、戊唑醇拌种处理和不拌种处理(空白对照)3个不同处理整体作为一个大的展示组进行统计分析，利用Mothur 软件计算文库覆盖率(Coverage)，Chao1指数及Shannon指数计算方法见文献[9]。采用R语言分析绘制样品OTUs的韦恩图。

2 结果与分析

2.1 不同拌种处理小麦根际土壤真菌群落丰富度和多样性变化

木霉菌能够防治小麦纹枯病、茎基腐病等多种小麦真菌病害，具有部分替代化学杀菌剂的潜力，而化学杀菌剂戊唑醇是目前小麦拌种过程中最常用的拌种剂之一，因此，我们选用戊唑醇作为对照药剂，希望通过研究不同拌种处理对小麦发育期根际微生物群落的影响，来指导木霉菌拌种剂在小麦生产过程中的使用。

群落丰富度(community richness)的指数，包括Chao 指数和ACE 指数，是采用不同算法估计样品中所含OTU 数目的指数，可反映群落物种丰富度，Chao 或ACE指数越大，表明样品中生物群落丰富度越高。由表1可以看出木霉菌LTR-2拌种处理和戊唑醇药剂拌种处理相较于不拌种处理的群落丰富度增加，其根际土壤真菌的Chaos指数分别增加了14.5%和43.9%，ACE指数分别增加了17.8%和 52.4%，表明拌种处理小麦可以增加小麦根际真菌的丰富度。

Simpson指数和Shannon指数反映了群落的物种多样性。其中Shannon指数反映的是群落的均匀度，Simpson指数则反映的是群落的优势度，其数值越大，表明生物群落内不同种类生物数量分布越不均匀，优势生物的生态功能越突出。由表1可知，虽然木霉拌种处理和戊唑醇药剂拌种处理和不拌种处理的小麦根际真菌的Shannon指数没有明显的区别，但木霉拌种处理的根际真菌Simpson指数相较于戊唑醇拌种处理和不拌种处理的小麦增加了24.5%和19.6%，这个结果表明，木霉LTR-2拌种处理可以增加土壤真菌群落中优势生物的生态功能，但并不影响其他真菌在真菌群落中的分布。

表1 小麦拌种处理根际土壤真菌多样性指数

2.2 拌种处理小麦根际土壤真菌群落结构的变化

拌种和不拌种处理小麦根际土壤真菌群落在门分类上的分布比例见图1。高通量测序的结果表明，各处理小麦根际土壤中鉴定得到的真菌主要来自 6 个门，包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、鞭毛菌门 (mortierellomycota)、壶 菌 门 (Chytridiomycota ) 、绿藻门(Chlorophyta)和毛霉亚门(Mucoromycota)。其中，优势菌群为子囊菌门、担子菌门和鞭毛菌门，这三种真菌在木霉、戊唑醇药剂和不拌种处理的小麦根际土壤中分别占真菌群落的 87.63%、85.47%和 91.12%。其中，两种拌种处理样品中子囊菌门真菌所占比例相较于不拌种分别减少1.64%和1.82%；鞭毛菌门真菌在两种拌种处理中比例分别减少了2.16%和2.25%；而担子菌门木霉拌种处理较不拌种比例略有增加，戊唑醇药剂拌种处理较不拌种比例减少了1.47%。上述结果表明，各处理中根际土壤真菌群落结构构成相近，但拌种处理的小麦根际土壤各真菌类群所占比例发生了明显的变化。

进一步从属的角度(图2)分析发现，各处理中根际土壤真菌群落在属水平上结构构成也是相近的，但各真菌类群所占比例同样发生了明显的变化。各处理小麦根际土壤优势种属有链格孢属(Alternaria)、赤霉属(Gibberella)、畸枝霉属(Malbranchea)、枝孢霉属(Cladosporium)、镰刀菌属(Fusarium)、孢霉属(Mortierella)、假裸囊菌属(Pseudogymnoascus)、腐殖菌(Humicola)。其中木霉拌种处理的小麦根际土壤中链格孢属、赤霉属、镰刀菌属所占比例较不拌种处理均有所降低，分别减低6.05%、5.25%、0.40%；戊唑醇拌种处理的小麦其根际土壤中链格孢属、镰刀菌属所占比例较不拌种处理降低了6.37%和1.04%，而赤霉属所占比例反而增加了4.47%。众所周知，链格孢属、赤霉属、镰刀菌属中有些种常会引起小麦真菌性病害，上述研究结果表明，采用拌种处理小麦可以降低小麦病原真菌在其根际土壤中的丰度，减少了病原真菌积累、降低了病害发生的几率，推测这是拌种处理防治病害发生的作用机制之一。

图1 门水平上的根际土壤真菌相对丰度柱形图Fig 1 The relative abundance of the soil fungal in rhizosphere relative to phylum level

图2 属水平上的根际土壤真菌相对丰度柱形图Fig.2 The relative abundance of the soil fungal in rhizosphere relative to genus level

2.3 不同拌种处理小麦根际土壤真菌群落OTU的特点

韦恩图可用于统计多个样品中所共有和独有的OTU 数目，从而直观地展现出样品中OTU 数目组成一致性及独有的情况。由图3可知，木霉LTR-2、戊唑醇和不拌种处理的小麦根际土壤之间存在共有真菌OTU 数量为800个(这个发育期5次取样样品总和)，木霉拌种处理的小麦根际土壤存在3 025个特异的真菌OTU，戊唑醇拌种剂处理的小麦根际土壤存在3 720个真菌OTU，而没有经过拌种处理的小麦根际特异的真菌OTU仅有2 834个，拌种处理所独有的真菌OTU数目均比不拌种处理的小麦根际土壤中的真菌OTU数量多，推测原因可能为拌种处理改变原有的真菌群落的动态平衡，使根际生态系统更容易接收获得外源性的特异性真菌类群，从而丰富了根际土壤中真菌的种类，但相对来说木霉菌LTR-2拌种处理对于真菌群落动态平衡的改变缓和些，而化学药剂处理则剧烈些，这种结果其实也与化学药剂杀菌没有选择性是一致的。

图3 木霉拌种处理小麦根际土壤真菌Venn图Fig.3 Venn diagrams of soil fungal community in wheat rhizosphere under Trichoderma seed coatings

3 讨论

通过对木霉菌拌种小麦的根际土壤中真菌群落进行宏基因组的高通量测序，发现木霉菌LTR-2拌种处理增加了小麦根际土壤中真菌群落的丰富度，并且其中有些真菌群落的优势度也发生了明显的改变，更为重要的是通过木霉拌种处理，根际土壤中一些小麦病原真菌的比例降低了[7]。以引起小麦根腐病的真菌离蠕孢菌(bipolarissorokinian)为例，高通量测序结果中发现在各处理根际土壤样品中均有分布，但在木霉菌拌种处理的样品中其丰度明显降低，仅为不拌种处理样品的12%，而戊唑醇拌种的样品中离蠕孢菌的丰度则是不拌种处理样品的2.4倍。黄世文等[10-11]报道木霉菌可以防治小麦根腐病，猜测通过木霉菌拌种可能通过占据生态位点等方式有效减少根际土壤中离蠕孢菌的含量，这可能也是其防病的作用机制之一。而戊唑醇作为一种内吸杀菌剂，能有效防治吸附在种子表面以及内部的病原菌，但并不能改变对土壤中或根际的病原菌的丰度，而丰度增加的原因尚不明了，因此，木霉拌种可能更适用于防治离蠕孢菌所引起的小麦根腐病。研究表明，发生植物土传病害的根际土壤中微生物多样性会降低，而引入外源生防菌能提高植物根际土壤中微生物的多样性，如谭兆赞等[12]通过使用接种微生物菌剂的堆肥提高了土壤中微生物的多样性，从而降低了番茄青枯病的发生；韩腾等[13]通过施用生防菌株枯草芽孢杆菌 (Bacillussubtilis) Tpb55提高了烟草根际土壤细菌多样性和群落结构稳定性，从而对烟草黑胫病有较好的防治效果，能减轻发病程度，延迟发病时间。因此，提高土壤及根际土壤的微生物多样性可能是生防菌发挥良好生防作用的重要机制之一。除此之外，通过木霉拌种还明显降低了根际土壤中链格孢属、赤霉属、镰刀菌属真菌的比例，这些改变也预示着木霉拌种对引发小麦土传病害的病原真菌具有积极的预防作用。