滋肾通窍饮对实验性糖尿病大鼠血清生长激素、视网膜毛细血管基底膜厚度的影晌

钟瑞英，俞晓艺，田 妮

糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是严重威胁人类健康和生命的常见疾病，发病率逐年增长，患病10年以上2型DM患者大多数都会发展成糖尿病性视网膜病变（diabetic retinopathy，DR)）[1]。 DR 是 DM 最常见的严重并发症之一，是反映机体代谢、内分泌及血液损害的典型微血管病变[2]，而传统中医药在治疗DR上已证实具有确切的疗效[3-6]。中药是否能通过对DM患者神经内分泌及免疫系统的调节，而发挥其防治DR特有的功效？从临床应用中药滋肾通窍饮治疗DR，发现治疗DR非增殖前期病变有良好的疗效[7]。本研究采用传统的DM模型：即链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)诱导的SD大鼠模型，观察滋肾通窍饮对DM大鼠的血清GH、视网膜毛细血管基底膜厚度的影响，从而探索滋肾通窍饮对糖尿病视网膜病变的作用机理，为中医药防治糖尿病性视网膜病变的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级健康成年SD大鼠50只 (约2月龄)，体质量（350±20）g，雌雄各半，广州中医药大学实验动物中心提供。检查屈光间质清，瞳孔等大等圆，对光反射好。所有动物全程分笼饲养在达标动物房内(由广州中医药大学动物实验中心提供)，全程颗粒饲料喂饲，不限饮水、进食，自然昼夜光线照明。室内通风良好，氨浓度小于2 QPPM，室温保持 18～22°C，相对湿度为40%～70%。

1.2 药品及试剂

滋肾通窍饮 处方组成：山萸肉20g、枸杞子15g、桑椹子 15 g、菟丝子 15 g、女贞子 15 g、石斛 12 g、黄芪 15g、太子参 20g、茯苓 15g、旱莲草 10g、泽兰 10g、田七 10g、丹参 10g、柴胡 12g、石菖蒲 15g、香附 12g、葛根20 g、升麻10g。由广州中医药大学第一附属医院制剂室将中药按比例每剂用300 ml清水浸泡30 min后，放入自动煎药机内，在压力1.5㎏、温度100°C状态下煎煮40 min，浓缩过滤，将药液装入真空袋内，每剂浓缩成40 ml，其浓度为5.9 g/ml。

导升明胶囊（奥地利依比威大公司，国药准字：H20070370）；链脲佐菌素(STZ美国 Sigma公司，批号：HZB0894)。

1.3 主要仪器

Accutrend alpha血糖仪（美国强生公司）。YB-6型生物组织包埋机 （湖北亚光医用电子技术研究所）。ZT-12H生物组织自动脱水机（湖北亚光医用电子技术研究所）。LEICA RM2025石蜡切片机（德国Leitz公司）。BH-2，BX-50生物显微镜（Olympus公司）。Cryostat172O恒温箱切片机 （德国Leitz公司）。超微切片机（德国Lei tz公司）。透射电镜H-800（日本日立公司）。

1.4 造模方法

参考预实验与文献方法[8]制作一个实验诱发的2型糖尿病大鼠模型，其发病过程及特征与部分患者的临床过程及代谢特征类似。将40只制模前大鼠禁食10h，自由饮水。将STZ溶于pH=4.5的0.1mmol/L枸椽酸钠缓冲液，配成1%STZ溶液，经紫外线消毒灭菌后，按60 mg/kg一次性大鼠腹腔注射。72 h后用尿糖试纸测尿糖，取鼠尾血测血糖，随机血糖浓度≥16.65 mmol/L，尿糖在++～+++者即为DM大鼠成功模型。血糖低于＜16.65 mmol/L的大鼠于禁食10 h后再次注射上述相同剂量的STZ累加成模，同法测血糖筛选出DM大鼠。造模成功后开始计算病程。此后每月测1次血糖，每周称体质量。所有大鼠在灌胃期间自由饮水进食，根据体重变化调整药物用量。

1.5 分组与给药方法

将造模成功的DM大鼠按随机数字法分为5组：正常组：灌胃蒸馏水2 ml，1次/d。模型组：灌胃蒸馏水2 ml，1次/d。滋肾通窍饮低剂量组：灌胃相当成人剂量5倍滋肾通窍饮制剂(23.6 g/kg)，1次/d。滋肾通窍饮高剂量组：灌胃相当成人剂量10倍滋肾通窍饮制剂，(47.2 g/kg)，1次/d。导升明组：灌胃相当成人5倍制剂(0.107 g/kg)，1次/d。持续3个月。

1.6 血清GH测定

取有盖的玻璃器皿放入适量的乙醚，待大鼠麻醉后，颈动脉插管取血，保存于-20℃储存待测。用低温大容量离心机分离血清，于37℃水浴孵育3 h,经三次非特异性洗脱,用放射免疫计数器测定血清GH。

1.7 电镜样品的制备及基底膜厚度测定

参考预实验与文献方法[9],过量麻醉处死大鼠，摘除眼球，自角膜缘后0.5 mm处剪开眼球,去除眼前节和玻璃体，取大鼠右眼球视网膜组织切成面积为1.5 mm×3 mm的小块，2.5%戊二醛、1%锇酸后固定，梯度乙醇脱水，树脂包埋，LKB超薄切片机切片，醋酸双氧铀及枸椽酸铅双重染色，取每份视网膜透射电镜下观察。

1.8 统计方法

2 结果

2.1 实验前各组大鼠体质量、血糖、生长激素值

40只SD大鼠共有37只成模。1只于造模后1 d死亡，2只于造模后第2 d死亡。与正常组比较，STZ诱导的模型组大鼠的血糖和血清GH的含量显著增加，差异具有统计意义（P＜0.05），提示STZ诱导的DM大鼠造模成功；造模成功后各实验组DM大鼠体质量、血糖、血清GH值比较均未见明显统计学差异(P＞0.05)。 （表 1）

表1 实验前各组大鼠体质量、血糖、生长激素值比较

表1 实验前各组大鼠体质量、血糖、生长激素值比较

注：*与正常组比较，P＜0.05

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2.2 滋肾通窍饮对DM大鼠体质量、血糖和血清生长激素的影响

与模型组比较，滋肾通窍饮高和低剂量组对DM大鼠的体质量具有升高的趋势，但滋肾通窍饮高、低剂量与模型组组间体质量值相比均未见明显统计学差异(P＞0.05)。此外，滋肾通窍饮高和低剂量组对DM大鼠的血糖具有降低的趋势，但滋肾通窍饮高、低剂量与模型组组间血糖值相比均未见明显统计学差异(P＞0.05)。滋肾通窍饮高和低剂量组治疗后DM大鼠的血清GH分别与模型组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，提示滋肾通窍饮具有抑制STZ诱导DM大鼠的血清GH升高作用。导升明阳性对照组治疗后血糖和血清GH与模型组比较，差异有统计意义 (P＜0.05)，提示导升明阳性对照组可抑制STZ诱导的血糖和GH升高作用。（表2）

表2 滋肾通窍饮对DM大鼠体重、血糖和血清生长激素的影响（s）

表2 滋肾通窍饮对DM大鼠体重、血糖和血清生长激素的影响（s）

注：* 与正常组比较，P＜0.05；# 与模型组比较，P＜0.05

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2.3 滋肾通窍饮对视网膜毛细血管基底膜厚度变化情况

正常组为连续的电子密度均匀的膜性结构，环绕内皮细胞及周细胞，基底膜清楚，连续完整。模型组电子密度不均匀，节段性结节样增厚。导升明组电子密度不均匀，连续弯曲增厚。滋肾通窍饮低剂量组电子密度不均匀，结构模糊，连续弯曲增厚。滋肾通窍饮高剂量组电子密度较均匀，结构清晰，增厚不明显（图1）。以上结果提示滋肾通窍饮可显著改善视网膜毛细血管基底膜厚度的作用。

3 讨论

非增生性糖尿病视网膜病变是糖尿病性视网膜病变的早期阶段，多数DM者特别是合并有DR的患者其血清GH水平一般较高[10-11]。血清GH能促进蛋白质的合成，能增强葡萄糖甙转移酶和半乳糖苷转移酶的活性，因而促进糖蛋白的合成，这些糖蛋白可沉积在毛细血管壁基底膜上，使基底膜不断增厚，进而促使糖尿病微血管病变的发生与发展[12]。研究证实，STZ诱导的DM大鼠的视网膜病变主要表现为外膜细胞损失，血-视网膜屏障损坏，毛细血管基底膜增厚，电子密度不均匀[9,13]。成模大鼠平均血糖值(21.47±1.99)mmol/L，DM 大鼠血清 GH 值（4.02±0.48）ug/L，成模大鼠与正常组大鼠的血糖值、血清GH值比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。模型组DM大鼠视网膜毛细血管基底膜电子密度不均匀，节段性结节样增厚（图1）。本研究也证实了糖尿病大鼠的血清GH水平比正常大鼠增高；毛细血管基底膜增厚，电子密度不均匀。治疗后，导升明组、滋肾通窍饮低剂量组及滋肾通窍饮高剂量组血清GH值比模型组低，而且中药高剂量组血清GH值为最低 （表2）。分别与模型组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，提示滋肾通窍饮具有改善STZ诱导DM大鼠的血清GH升高的作用。滋肾通窍饮低剂量组电子密度不均匀、结构稍模糊、连续弯曲增厚；滋肾通窍饮高剂量组电子密度较均匀，结构清晰，增厚不明显；滋肾通窍饮低剂量组、导升明组、滋肾通窍饮高剂量组对视网膜毛细血管的病理损害保护作用逐渐增强，主要体现在基底膜增厚的差异，这提示滋肾通窍饮可抑制视网膜毛细血管基底膜增厚，对视网膜毛细血管起到保护作用，尤其是滋肾通窍饮高剂量组疗效更佳，优于低剂量组表明本方的治疗效果与药物的剂量有关（图1）。

图1 滋肾通窍饮对视网膜毛细血管基底膜厚度变化的影响 （电镜，×10K）。1A正常组；1B模型组；1C导升明组；1D滋肾通窍饮低剂量组；1E滋肾通窍饮高剂量组

糖尿病视网膜病变属于瞳神疾病的范畴，在五轮学说中瞳神属水轮，内应于肾，肝肾同源，肝开窍于目，肝受血而能视，“五脏六腑之精气，皆禀受于脾，贯于目”“气脱者，目不明”。DR属慢性病，发生于糖尿病中后期，久病及肾，病久则肝气不舒，肝郁乘脾，脾虚失运，聚湿生痰，脾不统血，血溢脉外。近年来的文献发现，DR的治疗所选用的单味中药以补益药和活血化瘀药为多，补益药以滋补肝肾、益气养阴为主[14]。滋肾通窍饮以山萸肉、菟丝子、桑椹子、枸杞子、女贞子、石斛滋补肝肾生精血；黄芪、太子参、云茯苓等益气养阴，健脾渗湿；旱莲草、泽兰、田七、丹参等活血止血；柴胡、香附、石菖蒲，疏肝通窍；升麻、葛根轻清上目，引药上行。而且本方中所选的菟丝子、女贞子、葛根等有效成分有水飞蓟宾、槲皮素、黄芩甙、柚皮素等具有抑制醛糖还原酶作用，而前两者均含有中药黄酮类成分，有抑制蛋白非酶糖化作用，有抑制GH作用[15-19]。实验结果示滋肾通窍饮有改善STZ诱导DM大鼠的血清GH升高的作用，抑制视网膜毛细血管基底膜增厚。滋肾通窍饮对视网膜毛细血管起到保护作用机理可能是通过降低DM大鼠的血清GH水平，抑制视网膜毛细血管基底膜增厚，实现对视网膜毛细血管起到保护作用。