通窍活血汤灌胃对小鼠颅脑损伤的改善作用及其机制

杜勇，王革生，张淑敏，马涛，张少辉，宋光荣，刘晓汉，周玉嘉

1 北京中医药大学东方医院，北京 100078；2 民航总医院；3 北京中医药大学

创伤性脑损伤(TBI)是临床上的常见疾病，是创伤患者死亡和致残的主要原因[1～3]。TBI治疗难度大、治疗费用高，具有高致残率、高致死率的特点，给个人、家庭以及社会在经济、精神上都带来了巨大的负担[1, 4, 5]。因此，为该疾病寻找新的治疗手段和方法，找到高效的治疗药物具有重要临床和社会意义。由于TBI的原发性损伤无法逆转，因此，控制TBI继发性损伤至关重要。脑损伤后神经元丢失是导致继发性损伤的主要原因，坏死和凋亡被认为是神经元损伤的主要形式[6, 7]。坏死发生在损伤即刻，凋亡则具有一定的缓冲期限，提示凋亡可以作为治疗干预的生物学过程。自噬和凋亡之间存在一定的关联性，研究[8]显示，TBI能导致细胞自噬功能障碍，从而介导细胞死亡。药物激活自噬可以抑制细胞凋亡，提示自噬是一个非常好的药物作用靶点。细胞自噬包括大自噬、微自噬、核糖体自噬、聚集体自噬和线粒体自噬等多种亚型，其中线粒体自噬与疾病的关系是目前的研究热点之一[9, 10]。线粒体是细胞的能量工厂，对于细胞维持正常生理代谢发挥着重要的作用。研究[11]显示，TBI会促发线粒体功能紊乱，脑损伤后1～3 h即发生线粒体损伤，线粒体损伤和细胞存活、功能修复密切相关。线粒体自噬是一种选择性清除受损线粒体的自噬过程，可以保护细胞免受损伤线粒体或者促凋亡因子的损害[12]。2018年8月10日～2019年6月25日，本研究观察了通窍活血汤灌胃对小鼠颅脑损伤的改善作用，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 小鼠分组、颅脑损伤模型的建立及通窍活血汤的给予方法 60只小鼠随机分为假手术组、模型组和治疗组，每组20只。模型组和治疗组小鼠称重后用4%水合氯醛(1 mL/100 g)腹腔注射麻醉，头部剪毛消毒，于头皮正中切开，切口长2 cm，剥离右侧颅顶骨膜，固定于小鼠脑立体定位仪上，用颅骨钻刺一小孔，在左侧顶骨处钻一直径4 mm的骨窗，暴露硬脑膜并使其完整，采用改良自由落体法，使用40 g砝码从高20 cm处坠落撞击于硬脑膜表面的圆柱体，建立颅脑损伤模型，逐层消毒、缝合头皮后回笼饲养；假手术组麻醉后暴露骨窗，不击打脑皮质，缝合头皮后回笼饲养。各组小鼠建模后6 h开始给药，三组均给予凝血酶、甘露醇尾静脉注射，治疗组同时给予通窍活血汤颗粒剂(17.2 g/kg)灌胃。

1.2 各组小鼠神经功能损伤程度评估 各组小鼠建模后24 h时，使用改良的神经功能缺损评分(mNSS评分)评估神经功能损伤程度。mNSS评分主要包括提尾反射、行走测试、感觉测试、平衡测试、反射缺失和反常运动，总分18分，缺少一项反射或动物不能完成一项任务加1 分。

1.3 各组小鼠脑组织水含量测定 每组小鼠在神经功能损伤程度观察完毕后，各取3只处死，开颅去掉嗅球、小脑，取大脑损伤侧的脑组织，用滤纸吸尽表面血渍，置于已烤干并称重的锡纸上，用万分之一电子天平称湿重后，置入电热恒温干烘箱中，110 ℃下烘烤24～48 h至恒重，两次称重误差小于0.1 mg后，得其干重，参照Ellion公式计算小鼠脑组织水含量。小鼠脑组织水含量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.4 各组小鼠脑组织细胞凋亡率测算 每组小鼠在神经功能损伤程度观察完毕后，各取3只处死，取大脑损伤侧的脑组织，在恒冷冰冻切片机内切片，再用冷丙酮在4 ℃固定10～20 min，PBS洗涤2次，滴加蛋白酶K工作液(20 μg/mL)，20～37 ℃反应15～30 min，PBS洗涤3次，加入50 μL TUNEL反应混合液，37 ℃避光孵育60 min，PBS洗涤3次，滴加DAPI避光孵育5 min，PBS洗涤4次，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察并采集图像，计算绿色荧光细胞占总细胞的百分比，即为细胞凋亡率。

1.5 各组小鼠脑组织线粒体DNA(mtDNA)检测 采用PCR法。取各组小鼠脑组织，匀浆后在4 ℃条件下800×g离心5 min，取上清液0.5 mL加入含0.5 mL线粒体蛋白抽提试剂盒溶液A的离心管中，4 ℃条件下15 000×g离心10 min，离心后的沉淀即为线粒体。往沉淀中加入0.2 mL漂洗液重悬线粒体，4 ℃条件下15 000×g离心10 min，弃上清，每20 μL线粒体加入200 μL含有磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂和PMSF的冷裂解液，置于4 ℃摇床平台上温和振荡15 min，4 ℃条件下12 000 r/min离心15 min，上清液即为线粒体蛋白提取物。取线粒体蛋白提取物，采用SYBR Green法进行PCR扩增，引物序列如下：mtDNA正向引物为5′-CAGCCGCTATTAAAGGTTCG-3′，反向引物为5′-AGAGTGCGTCATATGTTGTTC-3′；β-Actin正向引物为5′-GTGTTCTGTTTCTCCTGGCA-3′,反向引物为5′-GGCATCCACGAAACTACCTT-3′。PCR反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40个循环。以2-ΔΔCt表示细胞中mtDNA的相对表达量。

1.6 各组小鼠脑组织中自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、p62及锰超氧化物歧化酶(MnSOD)、细胞色素C氧化酶Ⅳ亚型(COX Ⅳ)、切割活化的半胱天冬酶-3(cleaved Caspase-3)、凋亡抑制基因Bcl-2蛋白检测 采用Western Blotting法。取各组小鼠脑组织置于匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎，加含PMSF单去污剂裂解液于匀浆器中进行匀浆，裂解30 min后移至离心管中，4 ℃条件下12 000 r/min离心5 min，取上清与5倍蛋白上样缓冲液混合后，放入沸水中变性10 min，冷却至室温，120 V恒压凝胶电泳后进行转膜，转膜后的PVDF膜用含5%脱脂奶粉的TBST浸泡，室温摇床封闭2 h，加入相应一抗，4 ℃孵育过夜，TBST充分洗涤PVDF膜5～6次，加入HRP标记的相应二抗，X光胶片压片后依次放入显影液显影、定影液定影，冲洗胶片，运用Image J软件分析目的蛋白条带灰度值，计算目的蛋白相对表达量。目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。获得LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ蛋白相对表达量后，计算LC3 Ⅱ/Ⅰ。LC3 Ⅱ/Ⅰ=LC3-Ⅱ蛋白相对表达量/LC3-Ⅰ蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 各组小鼠神经功能损伤程度比较 假手术组、模型组、治疗组mNSS评分分别为(2.00±0.47)、(15.00±0.47)、(6.00±0.94)分，组间相比，P均<0.05，提示通窍活血汤有效地缓解了小鼠神经功能损伤情况。

2.2 各组小鼠脑组织水含量比较 假手术组、模型组、治疗组脑组织水含量分别为74.4%±0.36%、84.2%±0.64%和79.5%±0.70%，组间相比，P均<0.05，提示通窍活血汤有效降低了小鼠脑组织水含量。

2.3 各组小鼠脑组织细胞凋亡率比较 假手术组、模型组、治疗组细胞凋亡率分别为9.60%±1.87%、35.70%±6.61%和21.50%±5.19%，组间相比，P均<0.05，提示通窍活血汤可降低小鼠脑组织细胞凋亡率。

2.4 各组小鼠脑组织mtDNA相对表达量比较 假手术组、模型组、治疗组脑组织mtDNA相对表达量分别为1.028±0.233、0.040±0.003和0.510±0.201，组间相比，P均<0.05，提示通窍活血汤可以缓解由脑损伤所导致的mtDNA相对表达量减少。

2.5 各组小鼠脑组织中LC3 Ⅱ/Ⅰ、p62、MnSOD、COX Ⅳ、cleaved Caspase-3、Bcl-2蛋白相对表达量比较 各组小鼠脑组织中LC3 Ⅱ/Ⅰ、p62、MnSOD、COX Ⅳ、cleaved Caspase-3、Bcl-2蛋白相对表达量比较见表1。由表1可知，与假手术组相比，模型组和治疗组LC3 Ⅱ/Ⅰ、MnSOD、COX Ⅳ、Bcl-2蛋白相对表达量均显著降低，p62、cleaved Caspase-3蛋白相对表达量均显著升高；与模型组相比，治疗组LC3 Ⅱ/Ⅰ、MnSOD、COX Ⅳ、Bcl-2蛋白相对表达量均显著升高，p62、cleaved Caspase-3蛋白相对表达量均显著降低。

表1 各组小鼠脑组织中LC3 Ⅱ/Ⅰ、p62、MnSOD、COX Ⅳ、cleaved Caspase-3、Bcl-2蛋白相对表达量比较

注：与假手术组相比，＊P<0.05；与模型组相比，#P<0.05。

3 讨论

TBI是临床常见疾病，多由事故灾害以及运动损伤导致患者脑细胞神经元功能和结构的损伤[9]，可造成外界适应能力、感知能力和认知能力不同程度的降低，但其作用机制尚不清楚。 有研究[13,14]认为，通窍活血汤中的多种有效成分均起到了减轻颅脑损伤的作用，对脑损伤动物表现出保护作用，如川穹、红花和桃仁可以改善血液流变，麝香具有解毒活血以及开通诸窍的功能。本研究对通窍活血汤治疗TBI的机制进行了探讨，揭示了通窍活血汤在改善脑水肿等方面的作用及机制，为通窍活血汤临床治疗TBI提供更多的实验及理论依据。

mNSS评分从反射、平衡、感觉以及运动等几个方面评判小鼠神经功能损伤程度，小鼠的mNSS评分越高说明神经功能损伤程度越严重。本研究结果显示，模型组小鼠较假手术组的mNSS评分显著升高，经过通窍活血汤治疗后mNSS评分显著降低，说明通窍活血汤可以使小鼠的神经功能损伤程度得到有效地改善。我们还检测了小鼠的脑水肿情况，通过通窍活血汤治疗后小鼠的脑组织水含量显著降低，提示通窍活血汤对颅脑损伤的治疗具有显著影响。

近年来研究[13,14]表明，通窍活血汤对多种疾病的治疗作用可能是通过激活线粒体自噬，从而介导疾病的发生发展。然而通窍活血汤对颅脑损伤的治疗作用是否与线粒体自噬密切关联目前尚未见报道。但已有研究[15,16]表明，褪黑激素通过mTOR途径激活线粒体自噬，减轻脑损伤炎症，改善神经元死亡。本研究发现，通窍活血汤治疗的小鼠能够促进LC3-Ⅰ型向LC3-Ⅱ型的转换。自噬激活后，LC3-Ⅱ形成并位于自噬体膜的表面，是特异性表达于自噬体的分子标志蛋白，用于检测自噬水平，LC3 Ⅱ/Ⅰ的升高也提示了通窍活血汤可以促进细胞自噬的发生。进一步研究发现，通窍活血汤缓解了由于颅脑损伤所导致的p62蛋白的表达升高。p62蛋白参与信号转导、自噬与蛋白降解以及线粒体自噬，说明通窍活血汤可能通过提高p62蛋白的表达从而提高细胞自噬水平。

线粒体参与细胞内的能量供给，是细胞内重要的细胞器[17]。线粒体自噬是通过自噬清除细胞内受损线粒体。我们发现，通窍活血汤治疗后的小鼠脑组织中的MnSOD和COX Ⅳ的表达均呈现上升趋势，提示我们通窍活血汤可能促进了线粒体自噬的发生。研究[6,12]显示，自噬可以保护细胞免于受到外界刺激后引起的细胞凋亡，提示细胞自噬可以促进细胞的存活。本研究结果显示，通窍活血汤能够有效缓解由颅脑损伤导致的Bcl-2表达的下降和cleaved Caspase-3表达的上升，提示通窍活血汤通过激活线粒体自噬从而抑制细胞凋亡的发生。

综上所述，通窍活血汤灌胃可改善小鼠颅脑损伤情况，其作用机制可能与激活线粒体自噬、抑制细胞凋亡有关。本研究揭示了通窍活血汤改善颅脑损伤的机制作用，可以为颅脑损伤的临床治疗提供新的实验支持和理论依据。