甘草黄酮拮抗高糖诱导的视网膜色素上皮细胞损伤及分子机制

王 鹤，厉新新，孙晓会，吴红男，冯卓蕾，刘丽娟

甘草黄酮（licorice flavonoids），具有抗氧化、抑制炎症反应、降血脂、抗肿瘤等作用[1]。有研究显示，甘草黄酮能够预防大鼠实验性糖尿病的发生，其作用机制与提高超氧化物歧化酶表达有关[2]。糖尿病的发生与患者的长期氧化应激状态有关，视网膜色素上皮(retina pigment epithelium，RPE)细胞正常代谢环境改变导致抗氧化能力降低，影响了视网膜的正常代谢，导致糖尿病患者视力下降[3]。鉴于甘草黄酮具有较强的抗氧化性功能，本文拟通过采用体外高糖条件下培养RPE细胞，研究甘草黄酮对高糖诱导的RPE细胞氧化损伤的保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

RPE细胞(美国 ATCC公司)，甘草黄酮（美国Sigma公司，纯度＞99%)，二甲基亚砜（北京索莱宝科技有限公司），胎牛血清、DMEM培养基干粉 (美国GIBCO公司)，3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐 [3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司)，2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯 （2',7'-Dichlorodi hydrofluorescein diacetate，H2DCFDA）荧光探针（美国 BD 公司），Caspase-3及Caspase-9抗体（上海碧云天公司）。

1.2 方法

1.2.1 RPE细胞的培养 RPE细胞常规培养于10%胎牛血清的DMEM培养基内，每3 d传代1次，取对数期（此时期细胞都处于生长分裂旺盛时期，其细胞大小处于较稳定的情况）生长的细胞进行实验，培养箱内温度为37℃，CO2体积分数为5%。

1.2.2 RPE细胞分组 共分4组，每组5个复孔：（1）对照组 以正常培养液(葡萄糖浓度为5.5 mmol/L)培养细胞36 h。（2）高糖组 以葡萄糖浓度为40 mmol/L的培养液培养细胞36 h。（3）甘草黄酮低浓度组 10-9mol/L的甘草黄酮培养细胞24h后，更换为葡萄糖浓度为40 mmol/L的培养液继续作用12 h。（4）甘草黄酮高浓度组 10-8mol/L的甘草黄酮培养细胞24 h后，更换为葡萄糖浓度为40 mmol/L的培养液继续作用12 h。

1.2.3 MTT法测定细胞增殖 MTT法是一种检测细胞存活率的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能[4]。 RPE 细胞培养于 96孔板内，每孔 200 μl，细胞密度为 1×104个/L，各孔加入 10 μl MTT(5 g/L)，置于细胞培养箱内4 h，去除上清液，加入100 μl DMSO溶液，低速振荡10 min后在酶联免疫检测仪上测定各孔570 nm的吸光度值（OD）。

1.2.4 流式细胞技术检测RPE细胞内活性氧表达RPE细胞培养于6孔板中，每孔500 μl，细胞密度为1×105个/L， 磷酸缓冲液 （phosphate buffer solution，PBS）冲洗 3 遍，离心（1000 r/min）后收集细胞，黑暗中在室温下加入5 μl H2DCFDA染料，15 min后流式细胞仪检测并分析细胞内活性氧 (reactive oxygen species,ROS)表达量变化。

1.2.5 ROS含量变化的形态学观察 RPE细胞经上述方法处理后，加入10 μm/L的氧敏感荧光探针H2DCFDA，黑暗中在室温下孵育20 min，荧光显微镜下拍照。

1.2.6 细胞凋亡的形态学观察 采用Hoechst染色法定量观察细胞凋亡情况，按照试剂盒说明更换细胞培养液，并用PBS冲洗3遍，在150 μL的Binding Buffer中分别加入 Hoechst试剂 5 μl及 PI试剂 2 μl混匀，室温避光反应5 min，荧光显微镜下观查并拍照，统计分析凋亡细胞比例。

1.2.7 凋亡因子相关蛋白检测 收集细胞，置于冰浴上，胰蛋白酶消化后提取蛋白质并行10%SDS-PAGE凝胶电泳，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参照进行免疫印迹分析，检测细胞内Caspase-3及Caspase-9蛋白表达水平。

1.3 统计学处理

采用SPSS17.0进行统计学处理，结果采用均数±标准差（s）表示，采用成组 t检验及单因素方差分析(One-way ANOVA)）法进行分析，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 甘草黄酮浓度依赖性的提高RPE细胞活力

40 mmol/L葡萄糖溶液处理后，高糖组RPE细胞存活率下降到40.45%±3.27%，与对照组（98.336%±2.98%）比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。用10-9mol/L、10-8mol/L甘草黄酮处理后，RPE细胞存活率逐渐提高，分别为64.76%±3.23%和78.67%±2.57%，与高糖组（40.45%±3.27%）比较差异具有统计学意义(P＜0.05，表 1)。

2.2 RPE细胞内ROS改变

H2DCFDA荧光探针标记法是一种检测细胞内ROS生成量变化的检查方法，细胞氧化损伤程度越重，主峰越向右侧偏移[5]。流式细胞技术结果显示，对照组细胞内ROS表达均较低，ROS主峰位于基线左侧，高糖组DCF荧光信号明显增强，ROS主峰位于基线右侧，不同浓度甘草黄酮干预后，荧光信号强度逐渐减弱，ROS主峰向基线左侧移位（图1）。

表1 MTT法检测甘草黄酮对高糖诱导的RPE细胞存活率的影响（s）

表1 MTT法检测甘草黄酮对高糖诱导的RPE细胞存活率的影响（s）

注：*与对照组比较P＜0.05。

?

2.3 荧光显微镜观察细胞内ROS改变

荧光显微镜下，未发生氧化损伤的细胞核呈暗绿色低荧光，当氧化压力刺激时，ROS攻击细胞膜及细胞器，细胞核染色后呈亮绿色高荧光[6]。本研究结果显示，对照组细胞核表现为均一低荧光(图2A)；高糖组出现明显增多的绿色高荧光，提示细胞发生氧化损伤(图2B)；甘草黄酮处理后绿色高荧光细胞核数量逐渐减少，提示氧化损伤细胞随之减少 (图2C、2D)，说明甘草黄酮能够计量依赖性的抑制RPE细胞发生氧化损伤。

2.4 甘草黄酮对RPE细胞凋亡的影响

荧光显微镜下，对照组背景荧光暗黑色，可见数个散在凋亡细胞核（暗蓝色低荧光，图3A），细胞凋亡率为（1.67±0.98）%；高糖组细胞核着色不均匀，凋亡细胞呈亮蓝色高荧光 (图3B)，细胞凋亡率为（67.33±4.44）%，与对照组比较差异具有统计学意义(P＜0.01)。 10-9mol/L、10-8mol/L 甘草黄酮处理后凋亡细胞数量逐渐减少(图3C、3D)，细胞凋亡率分别为（48.67±3.90）%、（36.33±3.85）%，与高糖组比较差异具有统计学意义(P＜0.01)。

图1 流式细胞技术检测RPE细胞内ROS改变 横坐标是ROS荧光强度；纵坐标是细胞计数。1A为对照组，ROS主峰位于基线左侧；1B为高糖组，ROS主峰位于基线右侧；1C为甘草黄酮低浓度组，ROS主峰向基线左侧移位；1D甘草黄酮高浓度组，ROS主峰向基线左侧移位。

图2 荧光显微镜观察细胞内ROS改变 2A为对照组；2B为高糖组；2C为甘草黄酮低浓度组；2D为甘草黄酮高浓度组

图3 甘草黄酮对高糖诱导RPE细胞凋亡影响。3A为对照组；3B为高糖组；3C为甘草黄酮低浓度组；3D为甘草黄酮高浓度组

2.5 Caspase-3及caspase-9蛋白表达水平检测

RPE细胞经高糖处理后，凋亡蛋白Caspase-3及Caspase-9的表达均明显上调 （相对表达量分别为250.84%±8.90%及270.03%±5.90%），与对照组（相对表达量为105.71%±5.99%）比较差异极具有统计学意义 (P＜0.01)，甘草黄酮剂量依赖性的抑制Caspase-3及Caspase-9的表达，相对表达量分别下降到（162.70±6.44）%、（132.39±4.56）%和（224.85±5.44）%、（169.57±6.31）%，与高糖组比较差异均具有统计学意义(P＜0.05)（图 4）。

表2 各组RPE细胞凋亡率比较（

表2 各组RPE细胞凋亡率比较（

注：*与对照组比较P＜0.05。

?

表3 各组Caspase-3及Caspase-9蛋白相对表达比较（

表3 各组Caspase-3及Caspase-9蛋白相对表达比较（

注：以GAPDH为内参。单因素方差分析，两两比较采用LSD法。* 与对照组比较，P＜0.05； # 与高糖组比较，P＜0.05。

?

3 讨论

RPE细胞对氧化应激损伤敏感，而且一旦死亡便不能再生，因此，其结构与功能完整对维持视网膜正常功能至关重要[7]。为了研究视网膜病变的发生机理并探索出更多的治疗性药物，国内外学者尝试了大量方法诱导RPE细胞凋亡，例如：高糖、H2O2、紫外线辐射、激素、化学药物等[8-10]。本实验使用40 mmol/L浓度的葡萄糖建立了RPE细胞高糖氧化应激模型，观查甘草黄酮对RPE细胞的保护作用。结果显示，40 mmol/L浓度的葡萄糖引起RPE细胞活力降低，给予10-9mol/L、10-8mol/L甘草黄酮作用后，细胞活力增加。

当机体的抗氧化防御屏障功能被破坏时，会产生大量的ROS，ROS的生成与中和失衡，对RPE细胞造成不可逆损伤[7]。过量生成的ROS可直接或间接通过损伤线粒体DNA导致线粒体呼吸链功能受损，进一步促使ROS释放，最终形成恶性循环并加速细胞凋亡[10]。H2DCFDA荧光探针是一种检测细胞氧化应激状态的染色方法，本实验中，我们分别采用流式细胞技术及荧光显微镜观察高糖对RPE细胞的氧化损伤程度。2种观察结果结论一致：高糖刺激下RPE细胞氧化损伤明显，甘草黄酮可以剂量依赖性的抑制高糖诱导的RPE细胞氧化应激损伤。

高糖刺激RPE细胞后产生的大量氧化代谢产物堆积引起细胞毒性损伤，大量自由基通过线粒体损伤引起RPE细凋亡[11-13]。实验中，Hoechst染色显示，高糖组中凋亡的RPE细胞数量明显升高，Western blot结果显示，高糖组细胞中Caspase-3及Caspase-9蛋白的表达均明显增加，提示高糖诱导了RPE细胞凋亡，甘草黄酮通过降低Caspase-3及Caspase-9的表达发挥抗细胞凋亡作用。

综上所述，甘草黄酮能够有效抑制高糖诱导的RPE细胞凋亡，抑制效应与浓度呈正相关。本研究为预防和治疗糖尿病性视网膜病变提供了新的干预措施。

图4 甘草黄酮对RPE细胞内Caspase-3及Caspase-9表达的影响