朱砂叶螨几丁质酶TecCht1基因的原核表达与纯化

李 博，洪 鹏，沈宏亮，杨 金，卜春亚

(北京农学院生物科学与工程学院/农业部华北都市农业重点实验室，北京 102206)

朱砂叶螨(Tetranychuscinnabarinus)是一种世界广泛分布的害螨，具有繁殖速度快、种群密度大、个体小、极易产生抗药性等特点，所以防治十分困难[1-3]。此外，朱砂叶螨取食范围广，对果树以及玉米和棉花等农作物均造成不同程度上的危害[4-6]。有研究表明，朱砂叶螨已经对多种杀螨剂产生抗性[7,8]。每年中国需要很大部分的费用支出用于害螨的防治，并且至今仍处于不断上涨的趋势中[5,9,10]。且传统的杀螨剂，如有机磷类或氨基甲酸酯类杀螨剂，具有物种选择性差、易对螨产生抗性等特点[11]。开发和研制新型对朱砂叶螨有毒杀作用，但对其他非靶标有益生物无害的杀螨剂，具有十分重要的意义和应用价值。

几丁质(chitin)，是通过β-1,4-糖苷键连接聚合N-乙酰葡糖胺形成的线性多聚物[12]，又名壳多糖。几丁质酶(chitinase)是一种几丁质水解酶，最先在1921年由Folpmers从细菌中发现并提出[13]。几丁质酶可以将几丁质降解为分子量较低的二糖或三糖[14]，在昆虫体内几丁质酶的功能为降解围食膜与更替新旧表皮[15-17]。

在几丁质酶的8种类型[17-20]中，Ⅰ型几丁质酶是最具有特征的，其包括一个信号肽(signal peptide)、一个几丁质结合区(chitin-binding domain)、一个连接糖基化位点与磷酸化位点的连接区(linker)与一个活性位点区(catalytic domain)。Ⅰ型几丁质酶Cht1，其主要参与更替新旧表皮过程中对旧表皮的消化过程。

目前，哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、中国被毛孢(Hirsutellasinensis)、甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)、玉米螟(Pyraustanubilalis)、二化螟(Chilosuppressalis)、二斑叶螨(Tetranychusurticae)等几丁质酶基因已被成功表达[21-24]，关于蜱螨目几丁质酶表达的研究较少。几丁质在高等动植物中并不存在，参与昆虫几丁质代谢的酶类被认为是很好的杀虫剂靶标，几丁质酶作为新型杀螨剂的潜在靶标，有着十分广阔的应用前景和实践意义。

本研究以本实验室克隆的朱砂叶螨TecCht1基因为基础，对其催化结构域进行扩增，于pCold Ⅱ载体上进行原核体外表达，对重组蛋白进行纯化，对纯化后的目的蛋白进行Western Blot鉴定。为朱砂叶螨TecCht1的抗体制备、功能研究以及杀螨剂的研制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

菌株和载体：Trans-T1感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；pCold Ⅱ原核表达载体购自Takara公司；菌株DH5α、BL21购自北京鼎国昌盛生物科技有限公司。

主要试剂：T4连接酶购自北京全式金生物技术有限公司；TIANgel Midi Purification Kit、TIANpure Mini Plasmid Kit、2X Taq Mix购自天根生化科技(北京)有限公司；EX Taq酶、dNTP Mix、限制性内切酶(Sac Ⅰ和 EcoR Ⅰ)DNA Marker Ⅲ购自Takara公司；Cocktail蛋白酶抑制、一步法Western Blot试剂盒购自江苏康为生化试剂有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 引物设计 在本实验室已克隆的TecCht1基因以及结构域分析的基础上，利用Primer Premier 6.0，设计带有 Sac Ⅰ和 EcoR Ⅰ酶切位点，以及上游加His-tag标签的上、下游引物，用于扩增TecCht1基因的催化结构域区域的引物：TecCht1-F1为5′-CATCATCATCATCATCATGAGCTCGATAAAGTGTTGATATGT-3′，TecCht1-R1为5′-GAATTCTCAAGTACCAAGGAAATCATC-3′。

1.2.2 目的基因的扩增 以实验室保存的T/TecCht1为模板，TecCht1-F1、TecCht1-R1作为扩增引物，进行PCR反应。将PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳分离检测。将目的条带胶块，用TIANgel Mini Purification Kit回收。PCR扩增程序为95℃预变性 5 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 55 s，共35个循环；72℃延伸 10 min。

1.2.3 原核表达载体pCold Ⅱ/TecCht1的构建 将1.2.2步骤回收获得的PCR产物与载体pCold Ⅱ质粒分别用限制性内切酶 Sac Ⅰ和 EcoR Ⅰ进行双酶切反应。 37℃酶切2 h后，用1%琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物并回收目的基因及载体的DNA片段，随后用T4 DNA Ligase连接，转化E.coliDH5α感受态细胞，获得阳性克隆菌落。使用TIANpure Mini Plasmid Kit进行质粒的提取，随后进行双酶切鉴定，将验证正确的质粒交由生工生物工程(股份)有限公司测序，测序正确的重组载体用于TecCht1的诱导表达。

1.2.4 TecCht1的诱导表达 将测序正确的 pCold Ⅱ/TecCht1 质粒转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞，挑取单菌落，接种于3 mL含有氨苄抗生素的LB培养基，培养至OD600nm=0.6后，进行扩大培养。将此菌液全部加入到100 mL含有氨苄抗生素的LB培养基中， 37℃恒温180 r/min震荡培养，培养至 OD600nm值达到0.4～0.6；向全部菌液中加入终浓度为1 mmol/L IPTG进行诱导表达，15℃，110 r/min振荡培养，18、20、22、24、26、28、32 h分别取1 mL 菌液留样，利用SDS-PAGE电泳检测TecCht1表达量的情况，以及表达量与诱导时间的关系，确定最佳诱导时间为24 h。

1.2.5 TecCht1重组蛋白的可溶性分析 将含有pCold Ⅱ/TecCht1质粒的E.coliBL21(DE3)菌株划线培养，挑取单菌落，经3、100、1 000 mL的逐级放大培养后，加入终浓度为1 mmol/L的 IPTG，温度为15℃，110 r/min振荡培养24 h后，离心收集菌体沉淀。用PBS(pH 8.0)缓冲液洗涤后，沉淀用20 mL PBS缓冲液重悬，加入200 μL Cocktail蛋白酶抑制剂于垂直混合器中4℃反应1 h。功率380 w超声3 s，冷却10 s为一个循环，共进行170个循环破碎菌体；裂解完成后将裂解液于4℃ 7 800 r/min离心15 min，收集破碎后的上清和菌体沉淀。电泳分析重组蛋白的可溶性，电泳检测目的蛋白主要在沉淀中。

1.2.6 TecCht1重组蛋白的纯化 将收集的菌体沉淀用缓冲液A(140 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、1.8 mmol/L KH2PO4、8 mol/L尿素、10 mmol/L Na2HPO4)超声溶解。4℃条件下离心15 min。将上清液加至已平衡的5 mL Ni-NTA中，颠倒混匀结合过夜后，用50 mL结合缓冲液A洗去未结合蛋白。用50 mmol/L咪唑洗脱缓冲液洗去与Ni-NTA非特异结合蛋白，200 mmol/L咪唑洗脱缓冲液洗脱，收集TecCht1重组蛋白组分，测定组分OD280nm值，SDS-PAGE电泳检测纯化情况。采用Amicon©Ultra-15将纯化的重组蛋白溶液进行尿素的梯度去除以及超滤浓缩，先置换成含8 mol/L尿素的50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液；随后分别用6 mol/L尿素的50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液、4 mol/L尿素的50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液、2 mol/L尿素的50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液与不含尿素的50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液进行梯度置换，浓缩后的目的蛋白保存于-80℃。

1.2.7 TecCht1重组蛋白的Western Blot鉴定 为进一步验证目的蛋白的特异性，将目的蛋白进行SDS-PAGE电泳后，将蛋白转移到PVDF膜上。按照康为世纪一步法Western Blot试剂盒的操作，以兔源抗His-tag抗体为一抗，加入抗体孵育45 min，经洗膜后用ECL显色液显色。

2 结果与分析

2.1 目的片段的扩增

对目的基因进行扩增，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，目的条带大小正确，将目的条带进行胶回收(图1)。

注：M: DNA MarkerⅢ，1-2：TecCht1。Note: M indicates DNA MarkerⅢ, and 1-2 indicate TecCht1.图1 目的片段的扩增Fig.1 PCR amplification of the target fragment

2.2 重组载体的双酶切验证

将PCR回收产物与pCold Ⅱ空载体分别双酶切，连接转化后，进行重组载体的双酶切验证。阳性克隆双酶切后出现2条条带，大小与空载体和目的片段的大小相符，阳性克隆测序验证正确，说明pCold Ⅱ/TecCht1原核表达载体构建成功(图2)。

注：M:DNA MarkerⅢ，1-2：重组载体。Note:M indicates DNA MarkerⅢ, and 1-2 indicate recombinant vectors.图2 重组载体双酶切验证Fig.2 Restriction enzyme analysis of recombinant vectors

2.3 目的蛋白的诱导表达

将pCold Ⅱ/TecCht1质粒转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞，对转化后的阳性菌株进行诱导表达条件摸索。当诱导表达温度为15℃，IPTG终浓度为1 mmol/L，110 r/min振荡培养，诱导18、20、22、24、26、28、32 h后分别取样1 mL，进行SDS-PAGE检测，出现大小约42.3 kDa的目的条带，条带大小与目的蛋白的分子量一致。且在诱导表达24 h目的蛋白的条带最粗，且当诱导时间大于24 h，菌体对目的蛋白的表达量趋于稳定，所以确定诱导24 h为最佳诱导时间，可用于后续蛋白的大量表达纯化(图3)。

注：M：蛋白Marker 1：未诱导表达的全菌；2-8：诱导表达18、20、22、24、26、28、32 h后的全菌。Note: M indicates protein Marker, and 1 indicates no IPTG induction control, and 2-8 indicate bacteria proteins induced for 18、20、22、24、26、28、32.图3 IPTG诱导不同时间表达的TecCht1 SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of TecCht1 expression induced by IPTG

2.4 目的蛋白的可溶性分析

将离心收集的诱导表达后的菌体沉淀，加入PBS缓冲液重悬，经超声破碎后，分别对上清液和沉淀进行SDS-PAGE检测。目的蛋白几乎都在破碎后的沉淀中，表明目的蛋白为包涵体表达(图4)。

注：M：蛋白Marker 1：未诱导表达的全菌；2：诱导表达24 h后的全菌3：破碎后的上清液4：破碎后的沉淀。Note: M indicates protein Marker, and 1 indicates no IPTG induction control, and 2 indicates bacteria proteins induced for 24 h, and 3 indicates supernatant after ultrasonic disruption, and 4 indicates pellet after ultrasonic disruption.图4 SDS-PAGE分析表达的TecCht1的可溶性Fig.4 SDS-PAGE analysis of solubility of expressed TecCht1

2.5 目的蛋白纯化

将包涵体溶解离心后的上清液与Ni-NTA柱料结合，在4℃条件下纯化目的蛋白，随后进行复性，置换缓冲液，超滤浓缩后，进行SDS-PAGE分析。在43 kDa左右出现单一条带，说明获得纯度较高的目的蛋白(图5)。

注：M：蛋白Marker 1：纯化后的目的蛋白。Note: M indicates protein Marker, and 1 indicates purified TecCht1.图5 纯化后的TecCht1蛋白的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of purified TecCht1

2.6 目的蛋白的Western Blot分析

为进一步验证目的蛋白的特异性，将纯化后的蛋白进行Western Blot检测。在43 kDa左右出现特异性的目的条带，说明目的蛋白在pCold Ⅱ中成功表达，获得较纯的目的蛋白(图6)。

注：M：蛋白Marker 1：纯化后的目的蛋白。Note: M indicates protein Marker, and 1 indicates purified TecCht1.图6 纯化后的TecCht1蛋白的Western blot分析Fig.6 Western blot analysis of purified TecCht1

3 讨 论

几丁质是昆虫表皮和围食膜的重要组成之一，研究表明昆虫几丁质酶的功能为降解围食膜与更替新旧表皮[15-17]，它具有发育时期阶段性表达的特点。几丁质酶表达水平的变化可能是致命的。在防治中，几丁质酶本身可作为生物农药[25]，在饲料中添加，会加强其他农药对害螨的毒杀作用[26]，但因其纯化工艺具有较高的成本，几丁质酶的实际生物防治效果还有待于进一步深入研究。

大肠杆菌作为表达系统的一种重要工程菌，其最大的特点是有着清晰的遗传背景，且其结构简单，能够在短时间内大量表达外源蛋白，且其成本低和使用方便。存在容易形成包涵体的特点，经过变性复性过程，可能使蛋白丧失活性。在表达真核蛋白时，不具备转录后加工过程，容易导致蛋白的不正确折叠。

李宏伟等[27]用pET 32a 载体在大肠杆菌中表达美洲大蠊几丁质酶基因； Tetsuro Shinoda等[28]在原核表达系统中成功表达斜纹夜蛾几丁质酶基因；但棉铃虫几丁质酶在pET 21b载体未成功表达[29]。本研究采用pCold Ⅱ冷休克表达载体，有助于解决TecCht1基因表达难的问题。

本研究成功构建pCold Ⅱ/TecCht1表达载体，通过15℃低温诱导，成功表达朱砂叶螨TecCht1蛋白，并摸索出其最适诱导表达时间为24 h。以最佳诱导表达时间为基础，通过对目的蛋白的变性和复性，成功获得纯度较高的TecCht1蛋白。为朱砂叶螨TecCht1蛋白抗体的制备和功能研究奠定基础，为研制新型选择性杀螨剂提供新思路。