甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶SeCDA2a的外源表达及酶活力测定

陈 祎，张 伟，赵 丹，郭 巍*

(1.北京农学院植物科学技术学院，北京102206；2.河北农业大学植物保护学院，河北保定071001)

甜菜夜蛾SpodopteraexiguaHübner属鳞翅目Lepidoptera、夜蛾科Noctuidae，是一种全球性害虫，寄主繁多，中国20多个省、市、自治区均有甜菜夜蛾的为害记录[1]。由于甜菜夜蛾迁飞性惊人，世代重叠严重，发生规律复杂，寄主植物种植面积不断扩大，并且长期以来，单一使用化学药剂防治、盲目增加药量，使得该害虫抗药性不断增加，防治效果不理想[2]。如何安全、有效防治甜菜夜蛾是一个亟待解决的问题。几丁质是昆虫表皮的主要结构成分，参与昆虫生长发育的全过程[3]。昆虫发育需要经历周期性的蜕皮和形成新表皮的过程，伴随着几丁质代谢[4]。几丁质脱乙酰酶(chitin deacetylase, CDA)的主要功能是催化几丁质N-乙酰氨基-D-葡萄糖胺脱去乙酰基变成脱乙酰几丁质[5]，是几丁质降解过程中极为重要的一类酶。

自2005年Guo等首次从鳞翅目夜蛾科昆虫粉蚊夜蛾(Trichoplusiani)中分离出CDA蛋白——TnPM-P42，并验证其具有几丁质结合活性后，研究者相继从其他昆虫中克隆得到编码CDA的基因并研究其重组CDA的催化活性[6]。2008年，Toprak等从蓓带夜蛾(Mamestraconfigurata)中肠分离得到McCDA1，其原核表达的McCDA1蛋白具有几丁质脱乙酰活性[7]。2012年，Zhong等在毕赤酵母中表达家蚕(Bombyxmori)BmCDA7，测得其几丁质脱乙酰酶活力为1.85 U/mL[8]。2015年，孙晓彤等在毕赤酵母GS115表达甜菜夜蛾SeCDA1，其几丁质脱乙酰酶活力为1.35 U/mL[9]。闫晓平等测得由甲醇诱导在毕赤酵母中表达的美国白蛾(Hyphantriacunea)HcCDA1重组蛋白的酶活力为1.685 U/mL[10]。2017年，赵盼等克隆得到飞蝗(Locustamigratoria)3个几丁质脱乙酰酶基因，测得由Ni-NTA亲和层析柱纯化后于Sf9细胞中表达的重组蛋白LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的酶活力分别为0.268、0.354和0.228 U/μL[11]。近年来研究表明，几丁质脱乙酰酶可以作为杀虫靶标，通过干扰几丁质代谢过程来实现对害虫的防治，具有广泛的应用前景。

本研究对编码甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶的基因Secda2a进行外源表达，并测定重组蛋白SeCDA2a的酶活力，从分子水平上研究甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶，为明确该酶在甜菜夜蛾幼虫体内的作用机制奠定理论基础，为研发新的生防措施提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试昆虫和昆虫细胞培养 甜菜夜蛾为本实验室人工饲养种群，幼虫以人工饲料饲养，成虫喂食10%白糖水。人工气候箱设置成以下参数：温度(26.5±1)℃，湿度为50%±5%，光照L∶D=14 h∶10 h。草地贪夜蛾细胞系(Sf9)，于27℃人工气候箱中培养，所用的Grace培养基加入10%的胎牛血清。

1.1.2 主要试剂及菌株 pMD19-T-Secda2a质粒(含SacI &NotI酶切位点及目的基因)、pET-28a质粒及pFastBac HT A质粒由本实验室保存。限制性内切酶、蛋白Marker购自Thermo公司；T4连接酶购自Promega公司；LA Taq酶、DNA Marker、DH5α感受态细胞购自Takara公司；质粒提取试剂盒及DNA凝胶回收试剂盒购自Axygen公司；BL21(DE3)感受态细胞、His抗体购自康为试剂公司；DH10Bac感受态细胞购自北京华越洋生物科技有限公司；Bacmid纯化试剂盒及Cellfectin Ⅱ reagent购自Invitrogen公司；胎牛血清购自四季青公司。

1.2 方 法

1.2.1 原核表达载体的构建与鉴定 用SacI &NotI酶切pMD19-T-Secda2a质粒和pET-28a质粒，使用凝胶回收试剂盒纯化酶切产物。使用T4连接酶将目的基因Secda2a和载体于4℃连接过夜。次日，产物转化E.coliBL21。挑取阳性重组子，提取质粒后进行PCR和酶切验证，验证正确后送至北京六合华大基因科技有限公司测序。

1.2.2 原核表达 将验证正确的阳性重组子接种于含有卡纳霉素的LB液体培养基中，37℃，220 r/min振荡培养过夜，次日，向含有卡纳霉素的新鲜LB液体培养基中接入1%体积的过夜培养的菌液，培养3～3.5 h，至OD600为0.5时，添加诱导物IPTG使其终浓度为0.50 mmol/L，于37℃对其进行诱导表达，并于诱导2、4、6、8 h分别取样1.5 mL，用于分析SeCDA2a重组蛋白的表达。

1.2.3 引物设计 使用DNAMAN 7.0软件分析Secda2a全长序列酶切位点，结合pFastBac HT A载体上的多克隆位点，设计基因特异引物，两端分别添加NcoⅠ &NotⅠ的酶切位点及保护碱基(F： 5′-CATGCCATGGATGGCTCGACACGCGTGTC TGTGTCTT-3′；R：5′-ATTTGCGGCCGCTCA CTTCTTAACATTGAAGCCTTCTCCC-3′)，引物序列中的酶切位点用下划线标出。

1.2.4 重组Bacmid的构建及鉴定 以pMD19-T-Secda2a质粒为模板，使用1.2.3中引物PCR扩增获得Secda2a全长基因，经凝胶回收试剂盒纯化回收，PCR产物和pFastBac HT A载体分别用NcoⅠ &NotⅠ酶切，酶切产物纯化后使用T4连接酶以5∶1的比例连接过夜，产物转化E.coliDH5α，挑取阳性重组子进行PCR和酶切验证。鉴定正确后将重组转座载体pFastBac HT A-Secda2a转化DH10BacTM感受态细胞，获得重组杆状病毒Bacmid-Secda2a。利用通用引物PUC/M13 F&R 进行PCR鉴定。

1.2.5 重组蛋白SeCDA2a在昆虫细胞Sf9中的表达 选取鉴定正确的重组Bacmid，纯化后利用Cellfectin Ⅱ reagent转染昆虫细胞Sf9，获得重组病毒P1，继续侵染Sf9细胞分别得到P2和P3病毒，收集P3病毒上清得到重组蛋白，具体步骤参照Invitrogen Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统说明书进行。以转染空载体的Sf9细胞培养液上清为对照，进行SDS-PAGE电泳，Western blot分析重组蛋白SeCDA2a的表达。

1.2.6 重组蛋白SeCDA2a酶活力测定 对硝基乙酰苯胺是一种无色晶体，易水解生成黄色针状结晶体对硝基苯胺，这种黄色晶体的水溶液在400 nm处有特异性吸光值。参考刘丽萍等的方法绘制对硝基苯胺标准曲线，参考Zhong等的方法用硫酸铵对真核重组蛋白SeCDA2a进行纯化作为酶液参与酶促反应[8,12]。

2 结果与分析

2.1 原核表达载体的构建与鉴定

目的基因Secda2a与pET-28a载体连接后转化大肠杆菌，挑取阳性重组子，提取质粒经PCR鉴定后，获得约1.6 kb的目的片段(图1)。重组质粒pET-28a-Secda2a经SacI &NotI酶切得到1.6 kb的Secda2a基因片段和5.4 kb的载体片段，与预期大小一致(图2)。表明原核表达载体pET-28a-Secda2a构建成功。

图1 重组质粒PCR鉴定Fig.1 PCR identification of recombinant plasmid

图2 重组质粒pET-28a-Secda2a酶切鉴定Fig.2 Restriction analysis of of pET-28a-Secda2a

2.2 SeCDA2a重组蛋白的原核表达

用终浓度为0.50 mmol/L IPTG在37℃对重组蛋白进行诱导，分别在诱导2、4、6、8 h取样，收集菌体沉淀进行检测。结果显示，E.coliBL21成功表达出约61 kDa的目的蛋白，且于4 h之后表达量达到最大(图3)。

注：0 h是pET-28a-Secda2a未经IPTG诱导；2、4、6、8 h是pET-28a-Secda2a经IPTG诱导2、4、6、8 h。Note: 0 h represents pET-28a-Secda2a not induced by IPTG; 2, 4, 6, 8 h represent pET-28a-Secda2a induced by IPTG for 2, 4, 6, 8 h.图3 SDS-PAGE与Western blot检测IPTG诱导表达的SeCDA2a蛋白Fig.3 SDS-PAGE and Western blot analysis of SeCDA2a expression induced by IPTG

2.3 重组Bacmid的构建及鉴定

以重组质粒pMD19-T-Secda2a为模板，利用特异性引物PCR扩增得到约1.6 kb的片段(图4)。重组质粒pFastBac HT A-Secda2a经NcoⅠ &NotⅠ酶切验证正确，表明重组转座载体成功构建(图5)。利用通用引物对重组Bacmid进行PCR验证，获得约3.9 kb的目的条带，表明重组Bacmid-Secda2a构建成功(图6)。

图4 甜菜夜蛾Secda2aPCR扩增产物Fig.4 PCR amplication product of Secda2a

图5 重组质粒pFastBac HT A-Secda2a酶切鉴定Fig.5 Restriction analysis of pFastBac HT A-Secda2a

2.4 重组蛋白SeCDA2a在昆虫细胞Sf9中的表达

Bacmid转染生长状态良好的Sf9细胞后，获得原代病毒，传代培养至第3代，Western blot检测SeCDA2a在昆虫细胞中的表达，得到约61 kDa的重组蛋白(图7)。

图6 重组Bacmid验证Fig.6 Dection of recombinant Bacmid

注：CK是未感染重组病毒的Sf9细胞培养液上清；1是感染重组病毒的Sf9细胞培养液上清。Note: 1 represents supernatant of Sf9 cell culture infected by Bacmid; CK represents supernatant of Sf9 cell culture not infected by Bacmid.图7 重组蛋白SeCDA2a在昆虫细胞Sf9中的表达Fig.7 Recombinant protein of SeCDA2a expression in Sf9 cells

2.5 重组蛋白SeCDA2a酶活力测定

本研究中对硝基苯胺的标准曲线的线性回归方程是y=0.1362x+0.0252，R2为0.9988，符合朗伯-比尔定律(图8)。呈浓度梯度的对硝基苯胺溶液在400 nm处的吸光值具有良好的线性关系，可以通过分光光度法定量测定对硝基苯胺。本研究测得Sf9细胞表达的重组蛋白SeCDA2a的酶活力是1.57 U/mL。

图8 对硝基苯胺标准曲线Fig.8 Standard curve of p-nitroaniline

3 讨 论

CDA是一种几丁质修饰酶，在昆虫体内的主要功能是脱去表皮几丁质中的乙酰基，生成脱乙酰几丁质，参与昆虫体内几丁质的代谢[13,14]。该酶可用于扰乱昆虫正常生长机制，从而达到对害虫生物防治的目的。

到目前为止，大量昆虫几丁质脱乙酰酶基因的功能通过转录水平分析和RNA干扰技术得以研究。根据序列相似度及所含保守区域多样性的不同，几丁质脱乙酰酶被分为I-V，共5类。其中，第I类和第Ⅱ类均包含三个保守区域，几丁质结合区、多聚糖乙酰基转移酶催化区和低密度脂蛋白结合区，第V类仅包含一个多聚糖乙酰基转移酶催化区[15]。近年来，对昆虫CDA蛋白的功能研究成果主要集中在两方面：一方面，第I类CDA蛋白参与调控昆虫的蜕皮过程[15-19]，另一方面，第V类CDA蛋白参与中肠免疫[20]。笔者在NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上分析SeCDA2a蛋白保守结构域，发现SeCDA2a包含三个功能域，属于第I类CDA蛋白，推测其在甜菜夜蛾的蜕皮过程发挥作用。

体外表达有催化活性的蛋白对于更好研究SeCDA2a的功能意义重大。本课题组孙晓彤在E.coli中表达61.5 kDa的重组蛋白SeCDA1(属于第I类CDA蛋白)，在毕赤酵母细胞和昆虫细胞High Five中均表达80 kDa的重组蛋白SeCDA1，并测出两种真核细胞表达的重组蛋白SeCDA1的酶活力分别为1.88 U/mL和1.35 U/mL[21]。本研究首次在大肠杆菌BL21和昆虫Sf9细胞中成功表达重组蛋白SeCDA2a，检测真核重组表达蛋白的几丁质脱乙酰酶活性；测得酶活力与孙晓彤等[21]、闫晓平等[22]的结果接近。为了进一步明确SeCDA2a蛋白的功能，仍需从转录水平和蛋白水平上对Secda2a基因进行组织定位分析和不同发育时期表达量分析；利用RNA干扰技术将Secda2a基因沉默，通过观察甜菜夜蛾的蜕皮情况，利用实时荧光定量PCR技术检测基因的沉默率。本研究实现甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶基因Secda2a的外源表达，测定重组蛋白SeCDA2a的酶活力。