肌动蛋白2基因（ACTG2）对肝癌肿瘤细胞侵袭转移促进作用的实验研究*

蒋晟昰，吴 育，石美琴，蔡 艳，缪 婧，杨水英

南通市中医院药剂科，南通226001

肝细胞癌（HCC）被公认为是世界范围内最普遍和最具侵袭性的原发性恶性肿瘤[1]。虽然随着基因组学的不断发展，人们对HCC发病进展的认知有了一定的了解。尽管当前针对HCC的治疗取得了不错的进展，但是由于HCC的侵袭性是基于肿瘤细胞的高度转移潜性，目前仍然无法提供有效靶向治疗。恶性肿瘤易转移至淋巴结，肝癌细胞是否扩散至淋巴结往往是评价肝癌细胞侵袭转移的首要指标，也是作为一个重要的预后评价指标[2]。HCC最大的危害在于其癌细胞的侵袭与转移，随着病程的发展，癌细胞可以从原发瘤固定部位转移侵袭至人体另一个软组织器官上。

前人研究发现，在原发性小肠神经内分泌肿瘤转移至淋巴结中检测到肌动蛋白2（actin gamma 2，ACTG2）表达水平[3]。而在几种不同的癌症中均已发现ACTG2的异常表达。与结肠癌相比，在正常结肠组织中ACTG2具有较低表达水平。ACTG2的高表达与恶性疾病有关的这些发现突出了ACTG2在治疗肿瘤进展中的重要作用；然而，ACTG2促进HCC侵袭转移的机制仍然很不清楚。故本研究探讨ACTG2在肝癌细胞的转移中的作用。

1 材 料

肝癌细胞HepG2、Bel-7404、Bel-7402、SMMC-7721和正常肝细胞LO2细胞均获自中科院细胞培养中心（CBTCCCAS，上海）；逆转录病毒pDisrup（Lipofectamine RNAiMAX，批号13778030，Thermo Scientific公司）；无胸腺裸鼠BALB/c（许可证号2008001641729，上海实验动物研究中心），饲养于南通大学实验动物中心；青霉素G钠盐（批号2013242）、硫酸链霉素（批号2012382）均购自Amresco公司；四甲基偶氮唑盐（MTT，批号G111A 22258402，Promega公司）；Transwell板（8μm，Corning公司）；化学发光试剂 （批号HK108231、IA110436，Pierce公司）。电泳仪（型号DYY-C，Bio-Rad公司）；FCE凝胶成像仪、DG5036酶联免疫检测仪（深圳市三利化学品公司）；SynergyTMHT多微孔板读数器（美国Bio-Tek公司）。

2 实验方法

2.1 MTT法测定

以MTT法测定癌细胞SMMC-7721增殖活力。将该细胞接种至96孔板中，每孔200μL，约1 000个细胞/孔。将96孔板置37℃、5%CO2温箱中培养12 h和24 h，使细胞贴壁。向每孔中加入20μL的试剂，继续孵育4 h。在酶联免疫检测仪490 nm处测定吸光度值。用SynergyTMHT多微孔板读数器读数、计数[4]。

2.2 逆转录病毒p Disrup和特异性靶基因ACTG2的shRNA构建体

基于MMLV逆转录病毒载体pLNCX作为骨架构建逆转录病毒pDisrup。根据晚期人体腺病毒2型mRNA内含子序列设计剪接供体和受体。含25μg·mL-1HCl的杀稻瘟菌素（Blasticidin S，Invitrogen，USA）对用于筛选pDisrup稳定转染的细胞。针对特异性靶基因ACTG2的shRNA成功构建（Santa Cruz Biotechnology，USA）。 使 用Lipofectamine RNAi MAX试剂（Invitrogen）进行瞬时转染，并遵循制造商的说明书。

2.3 3′-RACE实验

以3′cDNA末端快速扩增技术（3′-RACE）扩增与HCC内源性基因部分融合的neo基因。分离总RNA，用引物5′-CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGA GCTCAAGC-3′进行逆转录。将所得逆转录产物用以下引物进行巢式PCR：p1/q1（5′-ATGGGCTGACCGCT TCCT-3′和5′-CCAGTGAGCAGAGTGACG-3'）和p2/q2（5′-GACGAGTTCTTCTGACTAGCT AG-3′和5′-GAGGACTCGAGC TCAAGC-3′）。p1和p2位于neo抗性基因上，而q1和q2位于QT的特定序列上。将PCR片段亚克隆到TA克隆载体（Invitrogen）中行DNA测序[5]。

2.4 Western Blot测定ACTG2

用PBS洗涤ACTG2mut和野生型HepG2细胞两次后，以冷裂解液萃取细胞，4℃、15 000 r·min-1离心10 min。配制10%分离胶和4%浓缩胶，蛋白上样量为30μg，电泳结束样品转移至PVDF。用5%脱脂牛奶封闭1 h后，将膜放入杂交袋中与不同的特异性ACTG2一抗孵育。用PBS洗涤30 min后，将膜再与相应的辣根过氧化物酶的山羊抗兔二抗反应孵育，并与化学发光底物（PIERCE）反应。设置内参蛋白为GAPDH，采用Western Blot方法检测蛋白。

2.5 划痕实验检测ACTG2mut、野生型Hep G2和SMMC-7721迁移能力

将ACTG2mut、野生型HepG2和SMMC-7721细胞接种在60 mm的培养皿中并在37℃下培养过夜，当细胞长到融合成单层状态时，于无血清培养基中饥饿24h后，在融合的单层细胞上刮伤单层产生伤口，制造一个空白区域，在划伤后0h和24 h拍摄无细胞划痕面积。通过测量剩余无细胞面积与初始伤口面积的百分比来确定伤口愈合效果[6]。

2.6 集落形成评估SMMC-7721细胞增殖能力

将细胞以每皿含500个细胞的浓度接种于培养皿（直径60 mm）中，平行操作3次。3周生长后，将细胞固定并用0.1%结晶紫染色，计数可见菌落。所有实验重复至少3次。

2.7 Transwell实验测定ACTG2mut、野生型HepG2、SMMC-7721细胞侵袭能力

将含有1×105个细胞的500μL无血清培养基加入上室，并将750μL培养基加入下腔。在加湿培养箱中孵育6 h后，用棉签拭子擦洗去除膜上表面的非侵入性细胞，并将迁移到膜下表面的侵入性细胞固定并用0.1%结晶紫染色，然后通过显微镜拍摄膜并进行细胞计数。

2.8 免疫细胞化学检测细胞ACTG2干扰效果

在玻璃盖玻片上的细胞用预冷的丙酮固定，然后用PBS漂洗3次。将细胞在0.1%Triton X-100中透化，并与1%BSA/PBS孵育以阻断非特异性结合。随后，与兔单克隆抗体孵育来阻断ACTG2。用PBS洗涤后，将细胞与标记了辣根过氧化物酶的二抗反育山羊抗兔二抗（1∶60稀释，Boster Biotechnology）孵育。细胞核用DAPI进行复染。

2.9 体内实验性转移模型测定肿瘤转移

将24只无胸腺裸鼠BALB/c随机分4组。于裸鼠尾静脉注射5×105个细胞，其中HepG2细胞为对照组，余3组分别为稳定表达ACTG2的细胞组（ACTG2-OE组）、转染ACTG2 shRNA质粒的SMMC-7721组、Scramble阴性对照组。在接种2周后处死，并检查所有器官是否有肉眼可见的肿瘤转移。于HE染色解剖显微镜下观察肺转移结节。

2.10 定量实时PCR

使用RNEasy试剂盒（Qiagen）提取总RNA。使用QuantiTect Reverse Transcription试剂盒（Qiagen）对1μg RNA进行逆转录反应。用于PCR的引物如下（分别为正义和反义）：GAPDH：正向：5′-CTCACCGGATGCACCAATGTT-3′， 反 向 5′-CGCGTTGCTCACAATGTTCAT-3′；ACTG2：正向：5′-GCGTGTAGCACCTGAAGAG-3′，反向5′-GAATGGCGACGTACATGGCA-3′；在ABI Prism 7500热循环仪上用MESA GREEN qPCR MasterMix（Eurogentec）进行PCR扩增。用RT2 Profiler PCR EMT Array（Qiagen）进行基因筛选。

2.11 统计分析

数据以平均值±标准差（x±s）表示。使用T检验或单因素方差ANOVA分析，以事后Dunnett检验来评估两组结果的差异性。*P<0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 ACTG2对HCC侵袭与转移起着调节作用

为了阐明参与HCC细胞侵袭与转移的关键因子，将pDisrup载体转染到肝癌HepG2细胞中，并通过Blasticidin S筛选HepG2突变细胞，沉默ACTG2。通过划痕试验证明所选择的突变型HepG2细胞的迁移潜能。采用3′-RACE扩增具有增加或降低迁移潜力的细胞，分析与HCC细胞转移能力相关的特定基因。ACTG2与HCC细胞的侵袭转移密切相关，沉默的ACTG2即ACTG2mut具有较低的迁移能力。pDisrup定位插入于ACTG2的5′-基因（起始密码子129 bp），从而导致截短。利用Western Blot实验和细胞免疫荧光测定ACTG2是否在HepG2细胞中被干扰。如图1A-B所示，ACTG2mut细胞中ACTG2的表达大大降低。如图1C所示，对照细胞的划伤面积恢复56%，然而，ACTG2mut细胞划伤面积恢复缩小32%并且无法闭合伤口。这与Transwell实验结果一致，ACTG2mut细胞迁移穿过Transwell的膜，使之迁移率大大降低，见图1D。为了确定ACTG2表达的临床相关性，分析人类蛋白质图谱（www.proteinatlas.org）的临床标本中ACTG2表达，发现ACTG2在肝癌中具有阳性强表达，在正常肝脏中具有阴性弱表达，如图1E。ACTG2在HCC细胞系中表达水平较高，但在正常肝细胞LO2中显著降低（见图1G）。qRT-PCR实验显示，ACTG2过表达是由于ACTG2 mRNA水平的增加（见图1H），提示ACTG2的过表达促进HCC细胞转移。

图1 鉴别ACTG2在肝癌细胞的侵袭与转移中的作用

3.2 内源性ACTG2体外调节HCC细胞转移

为了确认ACTG2是影响HCC细胞侵袭与转移的关键因子，设计了干扰ACTG2的shRNA、将其转染于SMMC-7721细胞，获得稳定转染的SMMC-7721-shACTG2细胞，如图2A所示。接下来去阐明SMMC-7721细胞侵袭转移的降低是否由于shRNA干扰、使得ACTG2基因沉默。在划痕实验中，与对照细胞相比，SMMC-7721-shACTG2细胞其迁移率大大降低（见图2B）。Transwell实验也显示出一致的趋势，SMMC-7721-shACTG2细胞侵袭显著减弱（见图2C）。进一步考察ACTG2是否可以调节HCC细胞增殖，MTT实验和集落形成实验结果表明，在对照组细胞和SMMC-7721-shACTG2细胞之间的增殖没有明显差异（见图2D）。综合考虑，ACTG2 shRNA可以抑制HCC细胞的侵袭能力。

图2 shACTG2对肝癌细胞侵袭转移的影响

3.3 内源性ACTG2体内调节HCC细胞转移

为了证实ACTG2在肝细胞转移中的生物学作用，构建稳定过表达ACTG2的HepG2细胞中ACTG2-OE，见图3A。ACTG2过表达显著增加了HepG2细胞的侵袭与转移能力（见图3B-C）。最后，为了确定ACTG2-OE是否也导致体内HCC侵袭与转移的增加，将HepG2细胞、ACTG2-OE的HepG2细胞以及SMMC-7721-shACTG2细胞尾静脉注射到裸鼠体内，建立实验性转移模型。如图3D所示，ACTG2-OE的HepG2细胞产生的癌细胞侵袭转移性损伤数量显著增加，相反，转染shACTG2的SMMC-7721细胞导致肺转移灶数的减少。

4 讨 论

HCC是具有高转移潜力的、死亡风险最高的实体癌。癌转移是一个逐步的过程，主要依赖于宿主与癌细胞之间复杂微环境[7]。然而，目前尚无有效治疗方法解决肝癌侵袭转移问题，原因归咎于肝癌转移机制的复杂性[8]。

最近研究表明，ACTG2在恶性肿瘤中起着重要作用，ACTG2的过度表达在不同类型癌症的恶性进展中起重要作用[8]。在高转移性乳腺癌中，ECM蛋白质组学分析显示ACTG2表达上调。另外ACTG2在前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、睾丸癌和口腔鳞状细胞癌等侵袭性肿瘤中均有上调，该因子可用于恶性肿瘤的进展评价。到目前为止，未见到ACTG2在肝癌转移中的作用。在Mas肝脏数据库[9]和Wurmbach肝脏数据库[10]（图1F）中都显示出肝癌组织中ACTG2 mRNA水平明显高于正常肝组织。基于文献的研究，我们设计实验并最初发现ACTG2在肝癌细胞侵袭转移中的新特性[11]。

在本研究中，为了识别参与HCC侵袭转移的基因，采用专门设计的逆转录病毒载体（pDisrup）转染人肝癌细胞，pDisrup可以随机干扰基因组中的任何基因。通过杀稻瘟菌素Blasticidin S筛选出稳定转染细胞株，然后通过划痕实验检测其迁移潜能。采用3′RACE、即利用PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，对具有增加或降低迁移潜力的细胞克隆，进一步确定涉及HCC细胞转移的特定基因。结果发现，ACTG2参与HCC细胞的细胞侵袭转移。当ACTG2基因被插入突变破坏时，HepG2侵袭与转移被显著抑制。划痕实验和Transwell实验显示，当ACTG2基因沉默时，HCC细胞的侵袭转移能力显著削弱。相比之下，过表达ACTG2使得HCC的侵袭转移能力大大增强。更令人信服的是，沉默ACTG2显著地减少了SMMC-7721细胞在裸鼠体内的肺转移和体外的迁移率。在本研究中，发现了ACTG2促进了HCC细胞侵袭转移的发生，此结果可能为干预HCC治疗提供了新的靶标，从而改善了治疗HCC的现状。

图3 阐明ACTG2-OE在肝癌侵袭转移中的作用