HPLC-DAD法同时测定降压类保健食品中非法添加的12种化学成分*
2019-02-22杨敏智申兰慧
金 舒，杨敏智，申兰慧
无锡市药品安全检验检测中心，无锡214028
保健食品介于一般食品和药品之间，既有一般食品的功能，又有特定的保健功能，可以用来调节身体机能，提高人们抵御疾病的能力，降低疾病发生的风险[1]。降压类化学药降压迅速，疗效显著，因而在一些辅助降压保健品中非法添加氢氯噻嗪、硝苯地平等降压药的行为屡有发生[2]，其剂型及含量不可控，患者在未知的情况下同时服用了此类保健品和降压药，有极大可能使血压发生较大波动、甚至骤然下降，产生严重的副作用，甚至危及生命。
据目前文献报道，检测保健食品中添加降压类的化学成分的方法主要有薄层色谱法[3，4]、高效液相色 谱 法[5，6]、液 质 联 用 法[7，8]、气 质 联 用 法[9]。其 中 液 质联用法成本高昂，不如高效液相色谱法普及，但高效液相色谱法中同时测定10个以上成分的方法报道较少。因此，本实验建立了同时测定12种降压类化学成分的高效液相色谱方法，该方法采用C18化学键合相常规柱，耐用性好，分析速度快，操作简单，可以提高检测效率。
1 仪器与药品、试剂
1.1 仪器
岛津LC-20AD高效液相色谱仪（日本Shimadzu公司）；XS205电子天平（Mettler Toledo）；XP6电子天平（Mettler Toledo）；Elmasonic S100H通用型超声波清洗器（德国Elma公司）。
1.2 药品与试剂
对照品：阿替洛尔（批号100117-201105）、盐酸可乐定（批号100071-20106）、氢氯噻嗪（批号100309-201404）、卡托普利（批号100318-201103）、盐酸哌唑嗪（批号100164-201204）、苯磺酸氨氯地平（批号100374-201204）、利血平（批号100041-201213）、硝苯地平（批号100338-201404）、尼群地平（批号100585-201104）、尼索地平（批号100574-200401）、非洛地平（批号100717-201403）、尼莫地平（批号100270-200002），均购自中国食品药品检定研究院。
供试品：海洋降压酶蚁力神牌依欣胶囊（某厂，批号201508060，样品1）；清脂降压罗布麻决明子胶囊（某厂，批号20161005，样品2）；山楂降压胶囊（某厂，批号20140516，样品3）；正气元保压康TM菊花决明子糖果（批号20160922，阴性样品）均来自市场抽验样品。
试剂：乙腈（色谱纯，Merck）；甲醇（色谱纯，Merck）；磷酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；水为超纯化水（MIlli-Q超纯水仪制备）。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Agilent Extend C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相A：0.2%的磷酸水溶液，流动相B：色谱纯乙腈（梯度洗脱：0~9 min，10%B；9~25 min，10%~30%B；25~35 min，30%B）；检测波长：220 nm；柱温：35℃；流速：1mL·min-1；进样体积：10μL。
2.2 溶液的制备
对照品储备液：取上述12种对照品各约10mg，精密称定，各加甲醇10 mL溶解，分别制成浓度为1 mg·mL-1的对照品储备液。
混合对照品溶液：临用时，精密量取各对照品储备液各1mL，置于同一个50mL棕色量瓶中，加初始比例流动相［乙腈-0.2%磷酸溶液（10∶90）］稀释至刻度，混匀，制成每毫升各含20μg的混合对照品溶液。
对照品溶液：精密量取各对照品储备液1 mL，用初始比例流动相稀释制成每毫升各含20μg的单一对照品溶液。
供试品溶液：将供试品均匀研细，精密称取0.2 g，置于100 mL棕色量瓶中，加入适量初始比例流动相溶解，超声提取30 min，冷却至室温后，用初始比例流动相稀释至刻度，混合均匀，经0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。
阴性样品溶液：取不含上述12种降压类化学成分的阴性样品，照上述供试品溶液同法制备阴性样品溶液。
样品对照溶液：取不含上述12种降压类化学成分的阴性样品，研细，取约0.2 g，置100 mL棕色量瓶中，分别加入适量对照品储备液，按供试品溶液的制备方法制备样品对照溶液，使各成分的浓度与混合对照品溶液中各成分的浓度相当。
图1 高效液相色谱图
2.3 方法专属性
取混合对照品溶液、阴性样品溶液、样品对照溶液，按“2.1”项下的色谱条件进样测定，记录色谱图（见图1）。结果表明，12个组分之间完全分离（R＞1.5），峰型良好，样品对照溶液在与12种对照品色谱相应位置上出现一一对应的色谱峰，且DAD谱图与单一对照品溶液的DAD谱图一致，阴性样品在对照品相应的位置上未出现色谱峰。
2.4 标准曲线与线性范围
取12种对照品各约5 mg，用初始比例流动相制成浓度约为100μg·mL-1的混合对照品储备液。精密量取上述溶液适量，用初始比例流动相稀释成浓 度 为0.1、0.05、0.02、0.01、0.005、0.001 mg·mL-1的混合对照溶液。按“2.1”项下色谱条件进样测定，以标准曲线中进样浓度为自变量，相应的峰面积为应变量，绘制标准曲线，可得线性回归方程及相关系数，见表1。结果r均＞0.996 9，表明12种降压化学成分在0.001~0.1 mg·mL-1的浓度范围内线性较好。
2.5 进样精密度
精密量取“2.2”项下的混合对照品储备液，用初始比例的流动相定量稀释成浓度为0.02 mg·mL-1的混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，计算各成分峰面积的RSD在0.05%~0.94%（n=6），结果见表1，表明本方法有良好的进样精密度。
2.6 检测限和定量限
取“2.2”项下混合对照品溶液适量，用初始比例流动相逐级稀释，以3倍信噪比计算检测限（LOD），以10倍信噪比（S/N）计算定量限（LOQ），结果见表1。
2.7 重复性试验
平行制备6份样品对照溶液（按“2.2”项下方法），按“2.1”项下的色谱条件进样测定，结果各样品中12种化学成分峰面积的RSD为0.1%～0.8%（n=6）。
表1 各组分回归方程、相关系数、线性范围、进样精密度和检测限等
2.8 稳定性试验
取“2.2”项下样品对照溶液，按“2.1”项下色谱条件在不同时间段进样，记录0、2、4、6、8、12、24 h的色谱图，按峰面积计算，12个组分峰面积的RSD在0.3%~1.1%，结果表明，各组分在24h内稳定。
2.9 回收率试验
取阴性样品约0.2 g，精密称定并置于100 mL棕色量瓶中，平行操作9份，按高、中、低质量浓度，3份为一组，每份分别加入适量“2.2”项下对照品储备液适量，制备供试品溶液，按“2.1”下色谱条件进样测定并计算，平均回收率为94.1%～103.1%，RSD为0.89%～1.7%（n=9）。
取样品1约0.2 g，精密称定，置于100 mL棕色量瓶中，分别加入氢氯噻嗪对照品储备液（相当于样品中氢氯噻嗪的80%、100%、120%）各3份，再按高、中、低质量浓度分别加入其余11种“2.2”项下储备液适量，制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定并计算，平均回收率为94.8%～102.5%，RSD为0.86%～1.6%（n=9）。
取样品2约0.2 g，精密称定，置于100 mL棕色量瓶中，分别加入氢氯噻嗪和硝苯地平对照品储备液（相当于样品中相应成分的80%、100%、120%）各3份，再按高、中、低质量浓度分别加入其余10种“2.2”项下储备液适量，制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定并计算，平均回收率为95.2%～101.7%，RSD为0.91%～1.8%（n=9）。
样品3同法操作，平均回收率为95.3%～100.9%，RSD为0.88%～1.7%（n=9）。
2.10 样品测定
分别取样品1、样品2、样品3各3份，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，结果见表2。提取供试品色谱图中与对照品保留时间一致的色谱峰的紫外光谱图，与相应的对照品的紫外光谱图均一致。
表2 样品测定（n=3）
3 讨 论
3.1 柱温的选择
本实验考察了柱温对色谱峰的影响，结果显示，随着柱温的升高，色谱峰的保留时间显著降低，分离度略有改善。由于在30℃下基线波动较大，而温度过高容易对色谱柱造成损伤，以阿替洛尔为例考察柱效，结果显示，在35℃时各成分分离效果佳，故本实验柱温选在35℃。
3.2 色谱柱的选择
本实验考察了不同键合相色谱柱Thermo Syncronis C18（250 mm×4.6 mm，5μm）、Waters XBridge-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）、Waters XSelect CSH C18（250 mm×4.6 mm，5μm）、Agilent Extend-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）的分离效果。结果显示，Agilent Extend-C18色谱柱能使待测的12种组分均有适宜的保留，峰型均较好，且各组分的分离效果较佳。
3.3 波长的选择
国家食品药品监督管理局“药品检验补充检验方法和检验项目批准件（批件号：2009032）”[10]中阿替洛尔、氢氯噻嗪、盐酸可乐定、卡托普利、哌唑嗪、利血平的检测波长为220nm；六氢吡啶类降压成分氨氯地平、硝苯地平、尼群地平、尼索地平、非洛地平、尼莫地平检测波长为235 nm。本实验考察了220 nm和235 nm波长下各组分的色谱行为，结果表明，235 nm波长下卡托普利几乎无响应；但是220 nm波长下12个组分均有较高的响应，且各组分在该波长处的测定结果与在各自最大吸收波长处的测定结果一致。最终选择220nm为12个组分的检测波长。
