柱前手性衍生化-反相高效液相色谱法拆分布洛芬对映异构体

梅雪娇，卢定强，冷柏榕，严相平*

1南京工业大学药学院，南京211816；2南京工业大学江苏省药物研究所，南京211816

布洛芬（ibuprofen）为α-甲基-4-（2-甲基丙基）苯乙酸，是一种非甾体类消炎镇痛药。布洛芬由于其消炎、镇痛、解热作用效果好，不良反应小，已在全世界广泛使用。在结构上，布洛芬分子中侧链上有一个手性碳原子，因此，存在一对光学活性对映异构体。现代药理实验证明，右旋布洛芬的药理活性明显优于左旋体[1]。

布洛芬在体内有明显的药理活性差异，其异构体的分离检测具有重要的意义。国内外报道的关于布洛芬异构体的分离检测方法有多种，如手性HPLC色谱柱直接分离法、手性流动相添加剂法、TLC薄层色谱分析法、柱前衍生化试剂法[2-4]。由于手性色谱柱分离成本高；手性流动相添加剂法中添加剂的消耗量大；薄层色谱分析法不能准确定量分析；而在之前所报道的关于布洛芬柱前衍生化的方法中，试验步骤复杂，操作较为繁琐。

N′N-羰基二咪唑（简称CDI）是咪唑的衍生物，是一种重要的医药中间体，具有较强反应活性，可与羧基、氨基、羟基等官能团进行反应[5-10]；（R）-（+）-1-（1-萘基）乙胺（R-NEA）是一种重要的手性芳香胺类化合物，可作为手性衍生化试剂，增强布洛芬衍生产物的紫外吸收。本文利用CDI作为活化剂活化布洛芬的羧基基团，再用R-NEA作为衍生化试剂，对活化后的布洛芬进行柱前衍生，并用C18柱分离。本法操作简单、经济可行、重现性良好、衍生化产物稳定。

1 仪器与试药、试剂

1.1 仪器

岛津LC-2010A型高效液相色谱仪；UV检测器；Lcsolution色谱工作站；Sartorius BT25S电子分析天平；GL-88B涡旋混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）。

1.2 药品与试剂

（S）-（+）布洛芬对照品（纯度99.9%，批号101203-201201，中国食品药品检定研究院）；（R）-（-）布洛芬对照品（纯度99.9%，批号101405-201601，中国食品药品检定研究院）；1，1′-羰基二咪唑（CDI，国药集团化学试剂有限公司）；R-（+）-1-（1-萘基）乙胺（R-NEA）（纯度99%，Alfa Aesar）；布洛芬原料药（批号：170101、170102、170103，国内A公司生产）。磷酸、乙腈为色谱纯；水为纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相：乙腈-0.05%磷酸（68∶32）；流速：1.0mL·min-1；波长：225 nm；进样量：20μL；柱温：30℃。

2.2 溶液的制备

布洛芬对照贮备液的配制：分别精密称取10mg（S）-（+）-布洛芬对照品和10 mg（R）-（-）布洛芬对照品，置同一20mL量瓶中，加乙腈制成0.5mg·mL-1的布洛芬对照贮备液备用。

布洛芬对照溶液的配制：取布洛芬对照贮备液1.0 mL于10 mL量瓶中，加乙腈制成0.05 mg·mL-1布洛芬对照溶液。

样品溶液的配制：精密称取10 mg样品，置100 mL量瓶中，加乙腈溶解定容。

活化剂溶液的配制：精密称取CDI 37.5 mg，置100 mL量瓶中，加乙腈制成0.375 mg·mL-1的溶液，注意临用新配[13]。

R-NEA溶液的配制：精密称取R-NEA 100mg，置10 mL量瓶中，加乙腈制成10 mg·mL-1的溶液。

2.3 衍生化方法

将布洛芬对照溶液、样品溶液200μL与活化剂溶液200μL，振荡10s充分混合后，室温放置20min，经过活化反应后，加入R-NEA溶液100μL，振荡10 s充分混合后在80℃下反应2h。

2.4 系统适用性试验

取布洛芬对照溶液，按“2.3”项下方法进行衍生化反应，精密吸取20μL，按“2.1”项下色谱条件进样分析。（R）-（-）布洛芬/（S）-（+）-布洛芬的非对映异构体色谱峰的保留时间分别为25.6min和27.9min。分离度3.045，按（R）-（-）布洛芬衍生物峰计算理论塔板数2 621。结果表明，该方法分离效果好，专属性强。色谱图见图1。

图1 由R-NEA衍生的（±）-布洛芬的色谱图

2.5 线性关系考察

精密吸取布洛芬对照贮备液0.10、0.50、1.00、2.00、5.00 mL，分别置于10 mL量瓶中，用乙腈稀释并定容至刻度，得浓度为0.005、0.025、0.05、0.10、0.25 mg·mL-1的（S）-（+）-布洛芬/（R）-（-）布洛芬溶液。按“2.3”项下方法进行衍生化反应，按“2.1”项下色谱条件进样分析。以布洛芬溶液浓度（X）为横坐标，布洛芬衍生物峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，分别得（S）-（+）-布洛芬衍生物和（R）-（-）布洛芬衍生物的回归方程（n=6）为：Y=5.23×107X+1.17×105（r=0.9997）和Y=5.60×107X+1.33×105（r=0.9997）。（S）-（+）-布洛芬和（R）-（-）布洛芬浓度在0.005～0.25mg·mL-1范围内呈良好线性关系。

2.6 检测限和定量限

取（S）-（+）-布洛芬衍生化溶液及（R）-（-）布洛芬衍生化溶液，适量稀释，在20μL进样量下，当信噪比（S/N）为3时，测得（S）-（+）-布洛芬和（R）-（-）布洛芬衍生物的检测限（LOD）分别为0.010μg·mL-1和0.015μg·mL-1；当信噪比（S/N）为10时，测得（S）-（+）-布洛芬和（R）-（-）布洛芬衍生物的定量限（LOQ）分别为0.045μg·mL-1和0.05μg·mL-1。

2.7 进样精密度试验

精密吸取“2.5”项下0.05 mg·mL-1的（S）-（+）-布洛芬/（R）-（-）布洛芬衍生物溶液20μL注入液相色谱仪，连续平行进样6次，照“2.1”色谱条件进行分析，记录峰面积并计算相对标准偏差（RSD）值。（S）-（+）-布洛芬和（R）-（-）布洛芬衍生物峰面积的RSD分别为0.86%和0.90%，结果表明，本法进样精密度良好。

2.8 重复性试验

按“2.3”项的方法平行配制6份（S）-（+）-布洛芬/（R）-（-）布洛芬溶液，精密吸取20μL注入液相色谱仪，按“2.1”色谱条件进行分析，记录峰面积并计算含量和RSD值。（S）-（+）-布洛芬和（R）-（-）布洛芬衍生物峰面积的RSD分别为0.73%和0.86%，结果表明，本法重复性良好。

2.9 稳定性试验

按“2.3”项下方法操作，（±）-布洛芬溶液衍生化后分别于0、2、4、6、8、24、48 h进样，考察（±）-布洛芬衍生化溶液放置稳定性，在研究期间使用相同的流动相，结果48 h内，（S）-（+）-布洛芬和（R）-（-）布洛芬衍生物峰面积的RSD分别为0.50%和0.96%，结果表明，（±）-布洛芬衍生化溶液在室温条件下48h内稳定性良好。

2.10 回收率试验

精密称取（S）-（+）-布洛芬对照品10 mg共9份，分为3组分别加入8、10、12 mg的（R）-（-）-布洛芬对照品，置200 mL量瓶中加乙腈溶解定容；同样，精密称取（R）-（-）-布洛芬对照品10 mg共9份，分为3组分别加入8、10、12 mg的（S）-（+）-布洛芬对照品，置200 mL量瓶中加乙腈溶解定容，回收率溶液与布洛芬对照溶液按“2.3”项下方法进行衍生化反应，按“2.1”项下色谱条件进行分析，记录峰面积并计算加样回收率和RSD值，结果（R）-（-）-布洛芬和（S）-（+）-布洛芬的平均回收率分别为100.2%、99.10%，RSD分别为1.06%、1.43%。结果表明，本法回收率良好。见表1、表2。

表2 （S）-（+）-布洛芬回收率试验结果

2.11 样品测定

取3批样品，按“2.2”项下方法制备样品溶液，按“2.3”项下方法制备样品衍生化溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，170101、170102和170103共3批样品测定结果见表3。

表3 样品测定结果（%）

3 讨 论

3.1 衍生化试剂的选择及原理

CDI与酸的反应低毒，反应条件温和，转化率好。旋光纯手性试剂R-NEA，具有较强的紫外吸收，R-NEA作为衍生化试剂，可增强布洛芬衍生产物的紫外吸收，反应温和。该方法相比于其他衍生化方法操作步骤简单，衍生化试剂价格便宜。原理见图2。

3.2 衍生化条件的优化

3.2.1 CDI对衍生化效率的影响 CDI与羧基的活化反应温和且过量的活化剂不会影响衍生化反应。将过量的活化剂与布洛芬室温下分别活化5、10、15、20 min后进行衍生化反应，发现15 min以后产物峰面积未有明显变化。为保证其充分活化，选择最佳试验活化时间20 min。为使衍生化反应完全，活化剂和萘乙胺必须过量，过量的活化剂和萘乙胺与衍生物能很好的分离，不影响布洛芬异构体的分析。配制CDI与布洛芬物料比分别为1.91∶1、4.77∶1、9.54∶1、19.07∶1进行反应，室温下活化20 min后，加入过量R-NEA，80℃反应2 h后，结果表明，当CDI与布洛芬的物料比为4.77∶1~19.07∶1时，衍生物峰面积没有变化，为确保布洛芬被充分活化，故CDI与布洛芬的最佳物料比为5∶1。

3.2.2 R-NEA比例对衍生化效率 过量的RNEA胺可以保证反应充分进行，为避免R-NEA的浪费，取CDI与布洛芬物料比为5∶1活化后，RNEA与布洛芬物料比12∶1、30∶1、60∶1、120∶1进行反应，结果显示，R-NEA与布洛芬的物料比为60∶1~120∶1时，反应产物峰面积没有变化，故R-NEA与布洛芬的最佳物料比为60∶1。

3.2.3 反应温度和时间对衍生化效率的影响取“2.4”项下配制的（±）-布洛芬溶液200μL加CDI溶液50μL，活化20 min后，加入R-NEA 100μL，分别在20℃、40℃、60℃、80℃、90℃下反应2 h，试验证明温度越高反应速率越快，故以80℃为最佳反应温度，见图3。另取布洛芬溶液500μL加CDI溶液200μL，活化20 min后，加入R-NEA 100μL，在80℃下分别反应30min、1、2、4、6h，试验证明2 h以后峰面积没有变化，反应完全，故选择最佳试验时间2h，见图4。

图2 使用CDI作为活化剂，用R-NEA衍生布洛芬对映体

4 小 结

本实验采用柱前衍生化的方法，实现了布洛芬对映异构体之间的分离，精确度高、专属性强，衍生化产物稳定，操作简单，生成的衍生物可用普通C18柱分离，解决了手性柱难以解决的问题，可用于布洛芬对映异构体的分离和光学纯度的质量监控，在药物质量控制方面有很大的意义。

图3 反应温度对衍生化的影响

图4 反应时间对衍生化的影响