超高效液相色谱-质谱联用法测定人血浆中依非韦伦的浓度

陈莉梅，杨亚楠，陶春蕾

安徽中医药大学研究生院，合肥230012

依非韦伦（Efavirenz）是一种非核苷逆转录酶抑制剂（NNRTI），常与抗逆转录病毒药物联用，用于治疗儿童和成人的艾滋病病毒1型（HIV-1）感染[1]。依非韦伦片主要用于艾滋病患者的抗病毒治疗，为国家保障药物之一。我国目前由Merck Sharp&Dohme（Australia）Pty.Ltd.进口该品种的片剂和胶囊剂，于2016年实现进口药品国产化。依非韦伦片作为一线抗HIV病毒药物，临床需求量大。

国内外依非韦伦血药浓度的检测方法主要为高效液相色谱-质谱联用法（HPLC-MS），但尚未有全面的方法学验证内容供参考，且方法学验证中关于溶血及高脂样品的配制未有详尽描述。本试验采用超高效液相色谱-质谱联用法（UPLC-MS），作蛋白质沉淀的血样处理，以2015版《中国药典》为指导，进行了全面的方法学验证，为依非韦伦临床药代动力学研究与方法学验证提供检测方法及参考。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

Waters UPLC-API 4000三重四级杆串联质谱仪，超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；API4000质谱仪（美国AB公司）；百万分之一电子天平（XP6，梅特勒－托利多仪器有限公司）；离心机（G-16C，德国Sartorius公司）。

1.2 药品与试剂

依非韦伦标准品（USP，纯度99.7%，批号R038U0）；内标：依非韦伦-D5［TLC PharmaChem.Inc，纯 度96.2%（HPLC）/98.5%（Isotopic Enrichment），批号：1866-041A6，加拿大TLC制药公司］；乙腈（色谱纯，Sigma）；甲醇（色谱纯，Sigma）；乙酸铵（分析纯，aladdin）。

新鲜血浆由本校附属医院提供。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱条件 色谱柱：Phenomenex Gemini C18（2mm×100mm，5μm，110A）；流动相：乙腈-10mmol·L-1乙酸铵（80∶20），等度洗脱；流速：0.25 mL·min-1；柱温：40℃；样品盘温度：4℃；进样量：2μL。

1.3.2 质谱条件 ESI离子源；负离子模式，多反应监测方式（MRM）测定药物浓度；离子喷雾电压为-4200 V，离子源温度为550℃；依非韦伦及依非韦伦-D5去簇电压均为-90 eV，入口电压均为-10 eV，碰撞池出口电压均为-15eV，碰撞电压分别为-25eV和-24 eV；用于定量的离子对分别为m/z 314.2→243.9，m/z319.0→247.9。

1.4 血浆样品处理方法

精密量取血浆样品50μL于2.0 mL 96孔板中，加入内标工作溶液（2μg·mL-1）50μL，然后加入乙腈200μL，于4℃、4200r·min-1离心10 min。取上清液50μL至干净2.0 mL 96孔板中，然后加入乙腈200μL，涡旋混匀1 min，于4℃、4200 r·min-1离心10 min，待进样，进样量为2μL。

2 结 果

2.1 方法学考察

2.1.1 质谱分析 将依非韦伦、依非韦伦-D5储备液用甲醇稀释至1μg·mL-1，采用蠕动泵模式进样，按“1.3.2”项操作，进行碎片离子分析。图1为相应的二级全扫描质谱图。

图1 依非韦伦（A）、依非韦伦-D5（B）的[M-H]-的二级全扫描质谱图

2.1.2 专属性考察 当使用色谱方法测定待测物时，为区分生物基质中干扰的能力，分别取6名受试者的空白血浆各50μL，按“1.4”项下方法操作（不加内标）进样2μL，得色谱图2中A、B；将LLOQ（定量下限浓度）水平的依非韦伦和内标依非韦伦-D5溶液加入空白血浆中，同法操作，得色谱图2中C、D；代表性受试者用药后，同法操作，得色谱图2中E、F。依非韦伦和依非韦伦-D5的保留时间均在1.75 min左右，且空白血浆中的内源性物质不干扰依非韦伦和内标依非韦伦-D5的测定。

2.1.3 交叉干扰 为了评估待测物与内标物之间是否存在交叉干扰，分别考察了待测物对内标物的干扰及内标物对待测物的干扰，与同一分析批中LLOQ样品的内标物或待测物峰面积比较。结果显示，待测物对内标物干扰为0.0%，内标物对待测物干扰不大于1.0%，说明两者之间不存在交叉干扰。此项为选择性考察。

图2 血浆中依非韦伦及依非韦伦-D5的色谱图

2.1.4 标准曲线 绘制标准曲线的样品每天新鲜配制。使用空白基质配制7个浓度水平的标准曲线样品（每个浓度水平2个重复）。血浆中标准曲线质量浓度为：0.1、0.2、0.5、1、4、7、8μg·mL-1。分别以待测物依非韦伦浓度（X，μg·mL-1）为横坐标，待测物依非韦伦色谱峰面积（As）与内标物依非韦伦-D5色谱峰面积（Ai）的比值（Y=As/Ai）为纵坐标，用加权（1/X2）最小二乘法进行线性回归运算，求得的直线方程即为标准曲线。验证中某批次标准曲线回归方程为y=0.494x+8.32×10-6（r=0.999 1），线性范围为0.1～8μg·mL-1，最低定量浓度为0.1μg·mL-1，r>0.99，表明线性关系良好。

2.1.5 定量下限及精密度与准确度 血浆中质量控制（QC）样品的质量浓度为：0.1μg·mL-1（定量下限浓度，LLOQ）、0.3μg·mL-1（低浓度，LQC）、2μg·mL-1（中浓度，MQC）、6μg·mL-1（高浓度，HQC），以依非韦伦LLOQ、LQC、MQC和HQC四个浓度的质控样品考察批内及批间精密度与准确度，每一浓度平行制备6个样品。根据“1.4”项下方法分别处理3批。考察了定量下限，低、中、高浓度水平（LLOQ、LQC、MQC、HQC）下的批内及批间精密度（见表1），表明方法准确性与重现性良好。

2.1.6 提取回收率与基质效应 考察内标工作液浓度（2μg·mL-1）下和待测物低、中、高浓度（0.3、2、6μg·mL-1）下血浆样品的提取回收率，及待测物低、中、高浓度下血浆样品的基质效应。按“1.4”项下方法处理低、中、高浓度的血浆样品，得到提取基质待测物峰面积NEFV及内标物峰面积NIS。将待测物工作液及内标工作液混合，分别配制成0.050/0.333μg·mL-1（待测物/内标）、0.333/0.333μg·mL-1（待测物/内标）、1.000/0.333μg·mL-1（待测物/内标）浓度的中间溶液；将6种不同空白基质经“1.4”项下方法处理得到上清液；取中间溶液50μL，上清液50μL，乙腈150μL，混匀进样得到未提取待测物峰面积AEFV及内标物峰面积AIS。取上述中间溶液50μL，加入乙腈200μL得到纯溶液样品，进样得到待测物峰面积均值PEFV及内标物峰面积均值PIS。按下式计算：

结果见表2，提取回收率及基质效应的RSD均＜15%。

表1 依非韦伦的精密度与准确度

表2 依非韦伦提取回收率与基质效应

2.1.7 溶血及高脂效应 溶血及高脂效应属于基质效应的一种，可能影响分析物的定量。本试验使用模拟的溶血血浆样品（加入2%的溶血全血至未溶血的血浆中，视为严重溶血）及高脂血浆样品（在正常空白血浆内加入脂肪乳注射液，至少3mg·mL-1，以甘油三酯含量计算）配制成浓度为0.3、6μg·mL-1的血浆样品进行评估。结果得溶血及高脂效应的低、高浓度相对偏差在±15.0%范围内，即溶血及高脂基质效应不影响分析物定量。

2.1.8 稀释可靠性 在分析过程中，如果待测物浓度高于定量上限，则需要对血浆样品进行稀释。为了验证稀释质控样品被稀释后此样品仍在测定线性范围内、且浓度值可接受，用空白血浆配制高于高浓度的稀释质控样品（30μg·mL-1）。再用空白健康人血浆5倍稀释该样品，平行稀释6份，稀释后血药浓度为6μg·mL-1。稀释后样品随新鲜配制的标准曲线样品一同测定。测定的浓度乘以稀释倍数得到相应的稀释前浓度。进样后各浓度准确度偏差均在±15.0%范围内，且精密度（RSD）为2.2%。

2.1.9 储备液及工作液稳定性 将依非韦伦标准品溶于甲醇中，配制成1 mg·mL-1的储备液，将依非韦伦储备液用50%甲醇水溶液分别稀释成160μg·mL-1和2μg·mL-1工作液，考察依非韦伦储备液及工作液在室温放置和0℃～8℃冰箱放置的稳定性，与新鲜配制的依非韦伦储备液及工作液比较。本试验测得储备液室温放置23h、0℃～8℃放置43d的平均稳定性分别为99.9%、99.6%；工作液室温放置27 h、0℃～8℃放置43 d的平均稳定性分别为100.4%（ULOQ）、100.5%（LLOQ）和100.4%（ULOQ）、100.3%（LLOQ）。以上结果显示，质控样品每个浓度的平均值的准确度均在100.0%±15.0%范围内，且每个浓度的精密度应均＜15.0%，证明了在考察时间内储备液及工作液的稳定性良好。

2.1.10 血浆样品稳定性 取配制后的低浓度（0.3μg·mL-1）、高浓度（6μg·mL-1）血浆样品50μL，按“1.4”项下方法处理，随新鲜配制的标准曲线一同测定，每个浓度水平平行测定6份。结果显示各浓度准确度偏差均在±15.0%范围内，且精密度RSD均＜15%。验证了室温放置24 h稳定性、处理后室温放置20 h稳定性、处理后0℃～8℃放置99 h稳定性，5次反复冻融（-20℃和-70℃）、长期冷冻稳定性（72 d）及处理后样品再进样稳定性（96h）、全血稳定性（室温及冰浴条件下各放置2h，与放置0 h样品比较两者差异的%）等。表明本试验所开发的方法可以保证不同情况下生物样品的稳定性。

2.1.11 最大进样针数 为评估分析批最大进样针数及方法的耐用性，经验证分析批最大进样针数为197针，即在生物样品分析中各分析批内进样针数不得超过197针。

2.2 方法学应用

经上海市公共卫生临床中心伦理委员会审核批准，本试验招募36名健康受试者（男女比例适当），受试者对本试验知情同意并签署知情同意书。受试者随机分成A、B两组，每组各18名。实验为：第一周期18例受试者空腹口服试验制剂（A药）600mg，240 mL温水送服；另外18例受试者空腹口服参比制剂（R药，STOCRIN®）600mg，240 mL温水送服；35 d后交叉给药。

根据原研说明书和调研文献[2，3]表明，依非韦伦的健康成人的平均消除半衰期为52~76 h，根据《中国药典》2015版附录中“化学药物人体相对生物利用度和生物等效性研究技术指导原则”及2016年国家食品药品监督管理总局下发的《关于发布普通口服固体制剂参比制剂选择和确定等3个技术指导原则的通告（2016年第61号）》之附件3“以药动学参数为终点评价指标的化学药物仿制药人体生物等效性研究技术指导原则”等的相关要求及规定，建议药物人体生物等效性试验中清洗期一般不应短于7个消除半衰期。参照本品药动学特征，依非韦伦的健康成人的平均消除半衰期为52~76 h，为了避免上个周期内的处理影响到随后一周期的处理，因此确定本次生物等效性试验清洗期为35d，即清洗时间约为840 h，大于7个清除半衰期，完全符合相关要求。采血点为给药前及给药后0.5、1.0、1.33、1.67、2.0、2.33、2.67、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、10.0、12.0、16.0、24.0、36.0、48.0、72.0h，共计24个采血时间点。

如图3所示，为35名受试者（018号受试者第二周期采血脱落，予以剔除，故不进行统计学分析）口服依非韦伦试验制剂与参比制剂600 mg后的平均血药浓度-时间曲线。结果表明，本方法测定依非韦伦可用于健康受试者的药代动力学研究。

图3 平均药-时曲线（x±s，n=35）

采用WinNonlin 7.0软件计算得到依非韦伦人体药动学参数（见表3），结果显示，空腹试验条件下试验制剂和参比制剂的吸收速度（Cmax和Tmax）和吸收程度（AUC0-72h）相当。空腹给药条件下Cmax、AUC0-72h的几何均数比值（试验制剂/参比制剂）的90%置信区间统计结果均在可接受的80.00%~125.00%等效范围内，分别为96.60%~111.31%、100.76%~109.80%。并经双单侧t-检验分析后，P值均＜0.05，即两制剂在本试验空腹给药条件下具有生物等效性。

表3 依非韦伦主要药动学参数（x±s）

3 讨 论

3.1 液相色谱条件及血浆样品处理方法

依非韦伦Log P=4.6，几乎不溶于水，故流动相选择大比例的有机相。文献[4，5]有使用（甲醇+0.3%甲酸）-（水+0.3%甲酸）（80∶20）及0.1%甲酸水溶液-甲醇（20∶80）作为流动相的，尝试后发现峰形较差，故尝试用乙腈-10 mmol·L-1乙酸铵（85∶15）作为流动相，发现峰形较好，随后在10 mmol·L-1乙酸铵中分别添加0.1%甲酸及0.1%氨水，发现待测物响应减小，故最终选择乙腈-10 mmol·L-1乙酸铵（80∶20）作为流动相。文献[6，7]有使用蛋白沉淀及液液萃取方法处理样品的，尝试蛋白沉淀法，发现回收率与基质效应等均能满足检测要求，且样品处理简便快速。因依非韦伦Cmax较大，定量下限较高，此方法的开发耗时较短。该方法操作简便、样品检测时间短，能达到准确定量及分析的目的。

3.2 采血点设计及受试者例数选择

由于依非韦伦分布和消除在个体内的变异较小且是一个长半衰期的药物，所以采用截取AUC来描述药物吸收的总暴露量，即用AUC0-72h来代替AUC0-t，同时结合WHO《Notes on the design of bioequivalence study：Efavirenz》建议采血周期为72 h，经综合考虑，最终确定采血周期为72 h。参考该品种相关WHO有关人体生物等效性试验记载，该品种人体生物等效研究的样本量在30~48例，依非韦伦片的变异系数20%~25%。通过统计软件计算受试者例数为19~28例，同时考虑脱落率问题，最终确定受试者人数为36例。

3.3 方法学验证的完整性

文献[4，6，8]中关于储备液及工作液的稳定性考察及溶血与高脂效应的具体操作未见详尽描述。本试验对于溶血和高脂样品的配制进行了描述并进行验证，还考察了不同贮备条件下待测物及内标溶液的稳定性。针对全血稳定性，大多数文献未对其进行考察，考虑到临床采血过程，本试验考察了室温及冰浴条件下放置2 h的全血样品的稳定性。试验包含了较完整的方法学验证内容，涵盖整个临床采血、样品运输及样本检测所可能出现的情况，试验结果显示，本方法能够准确定量人血浆中依非韦伦的浓度。