猪链球菌病实验室检测技术研究进展

杨慧敏，樊明明,吕玉金，3

(1.河南亚卫动物药业有限公司，河南 郑州450031；2.河南牧业经济学院 动物医学院，河南 郑州450046；3.河南省猪病防控工程技术研究中心；郑州 450046)

猪链球菌(Streptococcus suis，SS)是一种重要的人畜共患病病原菌，根据其荚膜抗原的不同，将猪链球菌共分为35种血清型，部分血清型具有致病性，如2型(SS2)毒力最强，不仅对猪致病，还能引起人发病和死亡。猪链球菌病是国家规定的二类动物疫病，引起该病的病原主要是C群兽疫链球菌和类马链球菌，导致仔猪的脑膜炎、败血症等疫病，并常与多种病原混合感染，临床症状复杂，发病率和死亡率较高，给养猪业带来严重的经济损失；也可感染人，引起人的脑膜炎、心内膜炎以及关节化脓性炎症，严重的可引起死亡。

1998年和2005年，我国先后在江苏省和四川省两次暴发人感染猪链球菌2型的重大动物疫病群体事件，累计引起52人死亡，其中致链球菌中毒性休克综合征(Streptococcal toxic shock syndrome STSS)的患者死亡多达96.2%[1-4]。猪链球2型，在世界许多国家和地区广泛流行，因此，该病原菌的快速检测方法以及公共卫生学意义重大。目前除了常规的微生物学方法外，血清学方法、分子生物学方法以及高通量检测方法都取得了较大进展，本文就猪链球菌检测技术的研究进展进行综述。

1 血清学方法

血清学检测猪链球菌的常用方法有很多，包括凝集试验、ELISA法、胶体金免疫层析技术、荧光检测技术等，操作简便，灵敏度高，较为可靠。

1.1 凝集试验

猪链球菌的检测通常采用平板凝集试验或协同凝集试验，后者应用较为广泛。协同凝集试验是将猪链球菌抗血清与SPA结合，成为致敏的载体颗粒，与特异性抗原相遇时，出现凝集现象，而平板凝集试验是在链球菌的选择性培养基上加入抗猪链球菌血清，然后接种待检菌，能形成大的沉淀圈。

1.2 ELISA法

ELISA即酶联免疫吸附试验，Serhir等(1993)利用双抗体夹心ELISA法对猪链球菌1、2、1/2、3和22型进行检测，结果显示，特异性为97.6%，敏感性为62.5%，与标准检测技术(生化试验、协同凝集试验)的结果一致。此外，随着科学技术的发展，斑点酶联免疫吸附法(Dot-ELISA)由于操作相对简单、结果易于观察，也常用于链球菌的检测。欧瑜等[5]通过利用制备的猪链球菌溶菌酶释放蛋白(MRP)和胞外因子(EF)的抗体，建立了检测猪链球菌的Dot-ELISA和间接ELISA方法，灵敏度高，可用于流行病学调查。

1.3 胶体金免疫层析技术

该技术原理是将免疫金标记技术与抗原抗体的特异性反应结合在一起，以此鉴定细菌。因操作简单、灵敏高效、稳定性好、成本较低等优点，在临床及检疫诊断领域被广泛应用。鞠莹等[6]通过制备胶体金颗粒、猪链球菌2型(SS2)的多克隆抗体，并用胶体金颗粒标记SS2的多克隆抗体，制备了SS2的胶体金免疫层析试纸条，该试纸条灵敏度高、特异性好。

1.4 免疫荧光技术

该技术原理是将抗体或抗原用荧光物质标记，从而显示相应抗原或抗体的一种技术，因一般采用荧光物质标记抗体而进行示踪抗原，所以被称为荧光抗体技术。武红敏等[7]通过制备能与SS2的重要毒力相关因子抗体结合的CdSe/ZnS量子点荧光探针，达到了检测猪链球菌的目的。

2 分子生物学方法

该方法敏感性和特异性相对于常规检测技术有明显的提高，而且通过测序分析，可对致病菌的来源和进化过程进行研究，对发病猪的快速诊断和流行病学调查具有重要的意义。

2.1 PCR技术

PCR技术在病原检测方面具有高效率、特异性强和准确率高等的优点，近年来，被广泛应用于耐药菌和致病菌[8]的检测。国内外的研究人员开展了大量关于猪链球菌PCR诊断技术的研究，中国检疫科学研究院和江苏检验检疫局建立了猪链球菌2型的快速PCR检测方法，4小时内即可完成检测。

2.1.1 多重PCR

多重PCR可实现多个保守片段的同时扩增，相对于普通PCR具有较大优势。陈博文等[9]建立了能同时检测猪链球菌2型的CPS、MRP以及EF等毒力因子的多重PCR检测方法，并验证了该方法的可靠性。孙学飞等[10]建立了SS2的1、2、7、9血清型四重PCR方法。结果显示，对人工模拟感染实验的SS的敏感性为103CFU/g，快速有效，可在3小时左右得到检测结果。黄婕峰[11]建立了SS2的3型、8型、21型、23型血清型的多重PCR方法，敏感性、准确性、特异性都较好。

2.1.2 实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR(FQ-PCR)能实现病原体的快速准确检测，该方法克服了免疫学检测的不足，对确定疾病所处的感染阶段提供了检测手段。孙洋等[12]以SS2的特异性基因CPS2J为靶基因，利用SYBR Green I与双链DNA结合发光的原理，建立了猪链球菌2型的PCR检测方法，能实时定量检测SS2。

2.2 环介导等温技术(LAMP技术)

LAMP技术是核酸体外扩增技术，与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，能在等温条件下实现快速、准确、简便、低成本的基因扩增，具有高特异性和高灵敏性，在分子生物学检测领域得到十分广泛的应用，具有广阔的发展前景。

朱水荣等[13]针对SS2中国分离株(05ZYH33)89K基因序列设计LAMP引物4条，应通过优化LAMP反应体系，建立了检测SS2的方法，应用所建立的方法对SS2和其他菌株进行检测，结果显示SS2菌株检测结果为阳性，非SS2菌株结果为阴性。张凤玉等[14]设计合成了SS2 89K毒力岛Ⅳ型分泌系统的virB4-89K基因的LAMP引物，建立了高致病性SS2的LAMP方法，且该方法具有良好的特异性、敏感性。

2.3 利用分子伴侣(Cpn60)基因对猪链球菌的基因分群

分子伴侣(Cpn60)基因具有普遍存在性、高保守性和部分变异性的特点，可依据其对SS基因进行分群。Ronald Brousseau等[15]通过扩增分析猪链球菌中编码Cpn60的基因，结果显示与采用16SrRNA的分群结果相同，系统进化树和序列也相似，且Cpn60的区分度比16SrRNA更大，为快速鉴定血清型提供了可靠的帮助。

3 高通量检测技术

高通量检测技术包括基因芯片技术、高通量测序技术等。基因芯片技术又称DNA微阵列，其基本原理是核酸分子杂交，通过特定的基因序列设计引物和探针，制备检测用基因芯片，然后与PCR扩增后的荧光标记的靶标杂交，通过检测荧光信号的强度来分析、检测病原[16]。郑峰等[17]设计合成了猪链球菌cps1、cps2及cps9基因的保守区特异性寡核苷酸探针，实现了猪链球菌主要致病血清型SS1、SS14、SS2、SS1/2等的鉴别。刘玲玲[18]通过2型标准菌株特异性探针制作基因芯片，成功地检测到猪链球菌 2 型特异区基因。邱小彤[19]建立了使用Luminex xTAG技术可以同时检测21种猪链球菌的高通量检测方法，并能进行血清分型。

4 小结

猪链球菌是猪群中一种常见的条件致病菌，也是一种重要的人兽共患病病原，快速检测技术对该病的预防和治疗非常关键。微生物学和血清型诊断依然是最基本的诊断方法，随着新检测技术的快速发展和应用，免疫学技术如免疫荧光技术、胶体金免疫层析技术、ELISA法以及高通量检测技术等为猪链球菌的病原学鉴定及毒力因子的监测工作提供了更多更快速准确的方法，为疫苗研究和免疫防控提供科学依据。