海洋细菌的抑菌谱研究及鉴定

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(大连民族大学生命科学学院，辽宁 大连 116605)

从自然界寻找高效的能够抗人类病原菌、动物病原菌的的化合物一直是研究者的热点之一，如何从天然资源中筛选和研发新型的抗生素，也是最近研究的趋势。海洋微生物由于生存环境具有低温、高压、黑暗等特殊性，可能会产生结构新颖、作用机制独特的活性代谢产物，因此成为了近年来研究的热点之一[1-3]。

本实验以9种人类和动物致病菌致病菌(大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，白色念珠菌，弧菌，铜绿假单胞菌，沙门氏菌，肺炎克雷伯菌，屎肠球菌，鲍曼不动杆菌)为指示菌，研究海洋微生物的抑菌谱，并进行鉴定，为进一步研究其相关次级代谢产物以及其抗菌活性物质奠定基础，其应用前景广阔丰富。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验材料

海洋沉积物样品采集泥样为中国第六次北极考察沉积物样品。

指示菌：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、弧菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯菌、屎肠球菌和鲍曼不动杆菌，实验室保藏。

1.1.2 试剂

PCR试剂，购自大连宝生物公司。其他生化试剂均为国产分析纯。

1.1.3 培养基

LB培养基：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g·L-1，琼脂20g，氯化钠5g，去离子水1000mL，pH约为7.0。

营养肉汤(NB)培养基：18g，琼脂20g，去离子水1000mL，pH约为7.0。

脑心浸液肉汤(BHI)培养基：38.5g，琼脂20g，去离子水1000mL，pH约为7.0。

MRS培养基：52.2g，琼脂20g，去离子水1000mL，pH约为7.0。

1.1.4 仪器与设备

ZWY-A2102C双层可编程恒温摇床，上海智诚分析仪器制造有限公司；BSA224S电子分析天平，赛多利斯科学仪器有限公司；RE-52A 旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；SW-CJ-2FD 洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；MT-180B 生化恒温培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；DHG-9070A 电热恒温干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；HVE-50 高压灭菌器，日本HIRAYAMA公司。

1.2 实验方法

1.2.1 海洋微生物的分离

菌株的分离采用涂布平板法，具体操作如下：称取海洋沉积物样品0.5 g，加入60%的海水4.5 mL，混匀后静置2 h，取0.5 mL混合物，加入4.5 mL海水中，梯度稀释成7个不同的浓度，取10-7至10-4的稀释浓度，每个浓度取样50 μL，用玻璃棒在培养皿上涂布。将培养皿放在培养箱中28 ℃培养1～2 d。然后用接种针挑取形态不同的单菌落，在培养箱中28 ℃培养2～3 d，分离出单菌落[4]。

1.2.2 制备海洋微生物粗发酵液

将菌株按0.1%的接种量接种到海水配制的200mL的LB培养基中， 摇床培养24h，(37℃，180 r/min)，离心10 min(6000 r/min、4℃)，取上清。然后用旋转蒸发仪在50℃下旋蒸至干，用药匙抠出，加入3mL超纯水，将浓缩液经0.22 μm无菌微孔滤膜过滤，得到粗发酵液。

1.2.3 抑菌谱的测定

采用琼脂扩散法测定发酵液对9种病原微生物(大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，白色念珠菌，弧菌，铜绿假单胞菌，沙门氏菌，肺炎克雷伯菌，屎肠球菌，鲍曼不动杆菌)的抑菌活性。

6种常见病原微生物(大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，白色念珠菌，弧菌，铜绿假单胞菌，沙门氏菌)应用LB培养基；肺炎克雷伯菌应用NB培养基；鲍曼不动杆菌应用BHI培养基；屎肠球菌应用MRS培养基。

微波炉将培养基融化后，室温放置至40℃左右，接入100μL的病原微生物，轻摇混匀后倒平板，待平板凝固后用9mm的打孔器打孔，量取300μL海洋微生物的粗发酵液，加入打好的孔中，37℃培养24 h后，用游标卡尺测量每个抑菌圈的直径。实验重复3次。

1.2.4 菌种的鉴定

将挑选的抑菌效果好的菌株进行平板划线法进行活化，活化产物送到宝生物公司进行鉴定。将测序结果在GenBank中，通过BLAST进行比对，获得相似度较高的序列。将此序列与所测序列通过ClustalX进行比对，最后利用MEGA 6.0软件，构建出系统发育树，以确定该菌株的分类地位[5]。

2 结果与分析

2.1 抑菌谱测定结果

11株海洋细菌的抑菌谱测定结果如表1所示(注：打孔器直径9mm)。由表1可以看出，65号菌株具有较广的抑菌谱，对大肠杆菌，沙门氏菌，弧菌，铜绿假单胞菌，鲍曼不动杆菌表现为低度敏感；对肺炎克雷伯菌表现为中度敏感。

表1 抑菌谱测定结果汇总

注：+低敏；++高敏；+++极敏

2.2 65号菌株的鉴定结果

将序列同NCBI基因库里面记载的所有己测定生物的Nucleotide collection比较，根据供试系统发育树可以看出，65号菌株为芽孢杆菌。

图1 65号菌株的系统发育树

3 结论

本实验采用琼脂扩散法研究了11种来源于北冰洋沉积物的海洋细菌对9种人类和动物致病菌(大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，白色念珠菌，弧菌，铜绿假单胞菌，沙门氏菌，肺炎克雷伯菌，屎肠球菌，鲍曼不动杆菌)的抑菌谱。发现65号菌株具有较广的抑菌谱，对大肠杆菌，沙门氏菌，弧菌，铜绿假单胞菌，鲍曼不动杆菌表现为低度敏感；对肺炎克雷伯菌表现为中度敏感。经过鉴定，确定其为芽孢杆菌。

随着畜禽规模化养殖业的发展，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等已成为畜禽养殖场的主要病原菌，由这些病原性引起的疾病成为畜禽规模化养殖业的常见病[6-7]。而大肠杆菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌等也会引起人类的疾病。本实验筛选出的65号菌株，来源于深海，有可能会产生不同于陆生微生物的特殊的抑菌活性物质。具体有待于进一步的研究。