槲寄生多糖调控胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的机制研究

宣 平，李子芳，周 亮，李厥宝

宣平，李子芳，义乌市中心医院康复医学科 浙江省义乌市 322000

周亮，李厥宝，浙江省人民医院康复医学科 浙江省杭州市 310000

核心提要： 核转录因子-κB(nuclear factor kappa beta，NFκB)的信号传导可能与胃癌(gastric cancer，GC)发展及预后有关，槲寄生多糖可能通过抑制NF-κB信号通路，调节相关基因表达，抑制GC细胞增殖、迁移和侵袭.

0 引言

胃癌(gastric cancer，GC)是严重危害人体健康的一种消化道恶性肿瘤，其发病率和死亡率分别占世界恶性肿瘤的第5位和第3位[1]. 据我国国家癌症中心统计，2015年约有66.7万GC新发病例，是我国癌症患者死亡的主要原因[2]. 吸烟、高盐饮食、幽门螺杆菌感染等环境因素是GC的主要危险因素，预防和早期诊断有助于降低GC发病率[3，4]. GC发病早期无明显症状，多数患者就诊时已为晚期，化疗是晚期GC患者的主要治疗方式，但治疗效果欠佳[5]; 即使使用根治切除术，但术后易出现远处转移、局部复发，5年患者生存率仍难以提升[6].

中医药治疗是我国传统的疾病治疗方式，研究认为，传统中草药的使用能够提高GC患者机体免疫力，延长患者生存期[7]. 槲寄生是一种具有多种生物学活性的药用植物，其分离物中包含黄酮类、生物碱、萜类、糖类等高分子化合物，其中生物碱、糖类被证明具有抗肿瘤、抗病毒、抗辐射、抗氧化和抗感染等作用[8，9]. 为探讨槲寄生多糖(viscum coloratumpolysaccharide，VCP)在GC细胞增殖、迁移和侵袭中的作用，本文以不同浓度VCP干预SGC-7901人GC细胞，检测细胞增殖、迁移、侵袭和相关蛋白的表达，以期改善GC的早期预防及治疗.

1 材料和方法

1.1 材料 SGC-7901人GC细胞(批号： SGC-7901)购自ATCC; 槲寄生购自亳州市润元堂药业有限公司; 胎牛血清(批号： SH41288)、RPMI1640培养液(批号：SH30807)、胰蛋白酶(批号： 25200056)购自美国Gibco-BRL公司; MTT(批号： M2129)购自美国Sigma公司;BCA试剂盒(批号： PC0020)、二甲基亚砜(DMSO)(批号： D8370)、ECL发光液(批号： PE0030)、结晶紫(批号： C8470)、4%多聚甲醛(批号： P1110)、PVDF膜(批号： BSP0161)、RIPA裂解液(批号： R0020)购自北京Solarbio公司; 兔抗人周期蛋白依赖性蛋白激酶4(cyclin-dependent protein kinases 4，CDK4)多克隆抗体(批号： 11026-1-AP)、兔抗人MMP-2多克隆抗体(批号：10373-2-AP)购自美国Proteintech公司; 兔抗人核转录因子-κB(nuclear factor kappa beta，NF-κB)p65多克隆抗体(批号： ABP51955)购自武汉艾美捷科技有限公司; 兔抗人MMP-9多克隆抗体(批号： PAB0982)、兔抗人GAPDH多克隆抗体(批号： LS-C108027)购自上海煊翎生物科技有限公司; 酶标仪购自德国AID公司; 细胞培养箱购自上海复昌科技有限公司; 荧光显微镜购自上海炳宇光学仪器有限公司.

1.2 方法

1.2.1 VCP的提取： 参照文献[10]的方法，取2 kg槲寄生粉末，加入2 L95%乙醇溶解24 h后过滤，去除脂类杂质. 滤渣风干后加入适量蒸馏水，95 ℃浸提2 h，重复3次. 收集滤液，采用聚乙二醇透析浓缩，8000 g离心5 min去除杂质，Sevag法[11]脱蛋白. 向上清液中加入无水乙醇，调整溶液终浓度为80%，4 ℃过夜，3000 g离心15 min，弃上清.分别使用无水乙醇、丙酮、乙醚润洗3次，冷冻干燥后得到VCP.

1.2.2 细胞培养与分组： 使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液于37 ℃、5% CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养SGC-7901细胞，1-2 d换液一次，每隔3-4 d传代一次. 取生长对数期的SGC-7901细胞，胰酶消化并重悬，调整浓度为1×106个/mL并接种至96孔板. 将细胞分为对照(Control)组和VCP处理组. 处理方法： Control组： 常规培养; VCP处理组： 培养液中加入VCP并调整其终浓度分别为20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL，一次标记为20 μg/mL VCP组、40 μg/mL VCP组、60 μg/mL VCP组、80 μg/mL VCP组、100 μg/mL VCP组用于细胞活力检测. 后续实验中，以含终浓度为100 μg/mL VCP的培养液培养SGC-7901细胞，记为VCP组. 每组6个复孔，实验重复5次.

1.2.3 MTT法检测细胞活力： Control组、20 μg/mL VCP组、40 μg/mL VCP组、60 μg/mL VCP组、80 μg/mL VCP组和100 μg/mL VCP组细胞在37 ℃、5% CO2饱和湿度条件下培养48 h，每孔加入20 μL浓度为5 mg/mL的MTT，继续孵育4 h; 去除多余培养基，加入150 μL二甲基亚砜，振荡反应10 min，酶标仪检测490 nm处吸光度(A)值.

1.2.4 克隆形成实验： 取对数生长期的Control组和VCP组细胞，0.25%胰蛋白酶消化后吹打成单个细胞，悬浮于新鲜含10%胎牛血清的培养液中; 梯度稀释后接种于培养皿，轻轻转动使细胞分散均匀，继续培养至肉眼可见克隆形成，吸除培养液. PBS洗涤后加入适量甲醇固定20 min，0.2%结晶紫染色10 min，计数≥50个细胞的克隆数. 克隆形成率(%) = (克隆数/接种细胞数)×100%;

1.2.5 Western blot： 收集Control组和VCP组细胞，使用含蛋白酶抑制剂的RIPA细胞裂解液于冰上裂解30 min，4 ℃，12000 g离心15 min取上清液. BCA试剂盒测定蛋白样品浓度，取50 μg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳后电转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭液液室温封闭1 h; 分别加入兔抗人CDK4多克隆抗体(1：1000)、兔抗人MMP-2多克隆抗体(1：500)、兔抗人MMP-9多克隆抗体(1：500)、兔抗人NF-κB p65多克隆抗体(1：500)、兔抗人GAPDH多克隆抗体(1：1000)，4 ℃孵育过夜; 洗膜后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1：5000)室温孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min. ECL曝光显影，实验重复3次.

1.2.6 Transwell小室检测细胞迁移和侵袭： 取Control组和VCP组细胞，胰酶消化后用无血清培养基重悬细胞，调整浓度为5×104个/mL，取200 μL接种于包被和未包被基质胶的小室. 将小室放于含完全培养基的下室中常规培养24 h，弃去多余培养基，PBS洗涤后加入4%多聚甲醛固定30 min，0.1%结晶紫染色10 min，显微镜观察并随机选取6个视野拍照，计数.

统计学处理实验数据均以mean±SD表示，使用SPSS 19.0软件进行统计学分析，Graphpad prism 7作图.两组间数据比较采用t检验，多组间数据比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义.

2 结果

2.1 VCP抑制SGC-7901细胞增殖 使用不同浓度VCP干预SGC-7901细胞48 h后检测细胞活力，结果如图1所示： 对比Control组，20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL的VCP能明显抑制SGC-7901细胞活力(P＜0.05)，呈浓度依赖性. 浓度100 μg/mLVCP对SGC-7901细胞活力的抑制作用较大，用于后续实验.

2.2 VCP抑制SGC-7901细胞的克隆形成 由图2可知，经100 μg/mLVCP处理的SGC-7901细胞克隆形成数明显少于Control组(P＜0.05).

2.3 VCP抑制SGC-7901细胞中CDK4蛋白表达 以100 μg/mLVCP干预SGC-7901细胞48 h，Western blot实验检测CDK4蛋白表达. 结果(图3)表明： 对比Control组，100 μg/mLVCP能下调CDK4蛋白表达(P＜0.05)，差异具有统计学意义.

2.4 VCP抑制SGC-7901细胞迁移和侵袭 以100 μg/mL VCP干预SGC-7901细胞，使用Transwell小室检测细胞迁移和侵袭数变化. 显微镜下观察发现，视野内VCP组迁移和侵袭细胞数明显少于Control组(P＜0.05)，差异具有统计学意义(图4).

图1 槲寄生多糖抑制SGC-7901细胞存活率. aP＜0.05，与control组相比. VCP: 槲寄生多糖.

图2 槲寄生多糖抑制SGC-7901细胞克隆形成能力. aP＜0.05，与Control组相比.

图3 槲寄生多糖抑制SGC-7901细胞中CDK4蛋白表达. A: Control组和槲寄生多糖(viscum coloratum polysaccharide，VCP)组细胞中CDK4蛋白电泳图; B: Control组和VCP组细胞中CDK4蛋白表达水平. aP＜0.05，与Control组相比.

2.5 VCP抑制SGC-7901细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达 100 μg/mL VCP干预SGC-7901细胞48 h后，Western blot实验检测细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达. 检测结果如图5所示： VCP组细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达水平低于Control组(P＜0.05)，差异具有统计学意义.

2.6 VCP对NF-κB信号通路的影响 Control组和VCP组SGC-7901细胞培养48 h后，提取各组细胞总蛋白并采用Western blot法检测蛋白样品中NF-κB p65蛋白表达.检测结果如图6所示： 与Control组相比，VCP组细胞中NF-κB p65蛋白表达明显下调(P＜0.05)，差异具有统计学意义.

3 讨论

GC的临床表现多为食欲不振、腹部疼痛、吞咽困难、恶心呕吐、淋巴结肿大等，在中医范畴中属“反胃”“噎膈”“积聚”等，脾虚气亏、血瘀痰阻是GC的基本病机，应用中医药活血化痰、理气养血、补益脾胃为基本疗法[7，12]. 中药已广泛应用于肿瘤的临川治疗，在提高肿瘤患者免疫力、减轻放化疗副作用、改善患者预后方面取得了一定的效果. 已有研究[13，14]表明，白花蛇舌草、小柴胡汤、大黄等中药制剂在肝细胞癌的临床治疗中取得了显著的效果; 传统中草药半枝莲可抑制致癌物处理的小鼠乳腺癌癌前病变的发展，已被用作抗肿瘤药物.

槲寄生常寄生于桦、柳、榆树、梨树、枫树等树木的分支和主干上，其药理作用广泛，可用于关节炎、病毒感染、脂肪肝、癌症等多种疾病的治疗[15，16]. 夏超等[17]从槲寄生中分离提取了多种生物碱，并发现不同生物碱对乳腺癌细胞增殖均有抑制作用; 其黄酮提取物同样具有肝癌、膀胱癌等抗肿瘤活性[18].而VCP作为槲寄生的有效活性成分之一，能够调节细胞免疫和体液免疫，同时还能抑制肿瘤细胞增殖[19].王鹏雁等[20]研究发现，VCP通过调节肝癌细胞周期，抑制细胞增殖，并且促进肝癌细胞凋亡; 但其在GC中的作用尚无相关报道. 本研究中，以不同浓度(20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL VCP，干预SGC-7901细胞48 h并检测细胞活力，结果发现不同浓度VCP均能抑制SGC-7901细胞活力(P＜0.05)，且呈浓度依赖性. 100 μg/mL VCP干预SGC-7901细胞，视野内迁移和侵袭细胞数减少(P＜0.05).

图4 槲寄生多糖抑制SGC-7901细胞迁移和侵袭. A: Control组和槲寄生多糖(viscum coloratum polysaccharide，VCP)组细胞迁移数统计; B: Control组和VCP组细胞侵袭数统计. aP＜0.05，与Control组相比.

图5 槲寄生多糖抑制SGC-7901细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达. A: Control组和槲寄生多糖(viscum coloratum polysaccharide，VCP)组细胞中MMP-2和MMP-9蛋白电泳图; B: Control组和VCP组细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达水平. aP＜0.05，与Control组相比.

图6 槲寄生多糖对NF-κB信号通路的影响. A: Control组和槲寄生多糖(viscum coloratum polysaccharide，VCP)组细胞中NF-κB蛋白电泳图; B:Control组和VCP组细胞中NF-κB蛋白表达水平. aP＜0.05，与Control组相比.

NF-κB是细胞中重要的转录调节因子，能与免疫球蛋白κ轻链特异性结合，是NF-κB信号通路的核心; 细胞黏附因子、细胞趋化因子等均可刺激NF-κB从抑制状态转化为活化状态，激活NF-κB信号通路[21]. NF-κB信号通路是重要的细胞信号传导途径，参与细胞增殖、分化、凋亡等生物过程[22]. p65/p50二聚体是NF-κB的主要存在形式，当细菌、病毒等因素刺激使IκB激酶复合体活化，p65/p50二聚体移位至细胞核，从而诱导下游靶基因进行转录[23]. 毛俊[24]研究发现： 在乳腺干细胞癌变的过程中，NF-κB信号通路的激活促进了CDK4表达，周期蛋白依赖性蛋白激酶可与cyclin结合形成复合物，从而调节细胞周期. 此外，Lin等[25]研究发现，p65和磷酸化p105的表达水平可能与非小细胞肺癌患者预后有关. 本文研究结果表明，100 μg/mL VCP可下调SGC-7901细胞中CDK4、MMP-2、MMP-9和NF-κB p65蛋白表达(P＜0.05)，抑制细胞迁移和侵袭.

总之，VCP对SGC-7901人GC细胞增殖、迁移和侵袭有抑制作用，其机制可能是通过NF-κB信号通路调节CDK4、MMP-2、MMP-9蛋白表达来完成; 为VCP应用于GC的早期预防及临床治疗提供实验依据.

文章亮点

实验背景

槲寄生多糖(Viscum coloratum polysaccharide，VCP)能够调节机体免疫功能，对肝癌细胞增殖具有抑制作用，同时诱导细胞凋亡; 但VCP影响胃癌(gastric cancer，GC)细胞的相关研究较少.

实验动机

本研究旨在研究VCP对GC细胞增殖、迁移和侵袭的影响，并探讨其分子作用机制，以期望为解决GC治疗过程中的问题提供线索.

实验目标

探讨VCP对GC细胞增殖、迁移和侵袭能力的作用机制，以期为GC的治疗提供新方向.

实验方法

将用100 μg/mL的VCP处理的SGC-7901细胞，用MTT法、Transwell小室分析GC细胞对VCP的治疗作用，Western blot检测GC细胞中CDK4、MMP-2、MMP-9及核转录因子κB p65蛋白表达.

实验结果

本研究成功筛选出对GC细胞具有最佳作用效果的VCP浓度为100 μg/mL并发现，VCP治疗的GC细胞的增殖、迁移、侵袭能力均减弱，同时，失活核转录因子-κB(Nuclear factor kappa beta，NF-κB)信号通路.

实验结论

VCP可抑制GC细胞的增殖、迁移和侵袭，这与失活NF-κB信号通路有关，可为GC的治疗提供新药.

展望前景

本研究仅在体外研究VCP对GC细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用，并未在动物体内研究其对GC生长转移是否具有抑制作用，后期实验会进行该部分研究，以更清晰的展示VCP对GC细胞的治疗价值，也为VCP更广泛的临床应用提供更充分的理论依据.