BRAF V600E基因检测联合细针穿刺活检对甲状腺结节良恶性诊断中的价值

卢振启 龚文博 黑虎 秦建武

甲状腺癌是最常见的内分泌系统恶性肿瘤。近年随着高分辨率彩超的普及与人们在体检中对甲状腺检查的重视，在全球范围内甲状腺癌的检出率呈明显上升［1］。2018年全球癌症统计数据显示，甲状腺癌已成为全球癌症发病率第9 大肿瘤［2］。及时发现和诊断对缓解患者心理压力和提供有效的治疗十分重要。细针穿刺活检（fine needle aspiration biopsy，FNA）是目前评估甲状腺结节良恶性敏感度和特异度最高的方法［3-4］，但仍有10%～30%的结节无法明确诊断［5］。因此从基因水平寻找高相关性的肿瘤标志物尤为重要。有研究表明BRAF 基因作为甲状腺癌最常见的遗传学突变［6］，在甲状腺乳头状癌（papil⁃lary thyroid carcinoma，PTC）的发生发展中占据重要地位。FNA 联合BRAF V600E 基因突变检测进一步提高诊断的敏感度和准确度，对甲状腺癌的诊断、分层、治疗及预后的评估具有重要的指导意义［7］。本研究探讨BRAF V600E 基因检测联合超声引导下FNA对甲状腺良恶性结节的临床诊断价值。

1 材料与方法

1.1 临床资料

选取2018年1月至2018年6月郑州大学附属肿瘤医院首次收治、诊断为甲状腺肿物入院行FNA 及穿刺洗脱液BRAF 基因检测并接受手术的患者为研究对象。经过严格查阅与筛选的121 例共130 枚可疑结节纳入本研究。纳入标准：1）术前有完整高分辨率彩超记录且评估结节为可疑恶性（TI-RAS 分类4 类及以上结节）；2）术前行FNA 及穿刺洗脱液BRAF 基因检测；3）初次行甲状腺手术治疗；4）术后病理明确；5）具有完整病历资料及病理报告。所有患者穿刺及术前均签署知情同意书。排除标准：1）多次手术患者；2）非本院行FNA及穿刺洗脱液BRAF基因检测；3）病历资料不完整。

1.2 方法

1.2.1 穿刺方法 核对患者信息后患者取仰卧位，颈部垫高过伸位，颈部常规消毒，铺无菌洞巾，超声探头无菌处理，超声定位结节，设计穿刺路径，穿刺点进针。超声引导下用23G穿刺针进入甲状腺结节，在结节内重复提插穿刺针数次完成取材，每枚结节穿刺2 针，个别结节穿刺3 针。标本立即涂片固定，观察标本是否满足细胞学诊断要求。穿刺针用1 mL生理盐水冲洗，洗脱液用PE管储存，送本院分子病理科行RT-RCR检测［8］。根据需要重复穿刺步骤，通常每个结节穿刺2 次。穿刺完毕，贴敷料，在观察区留置观察20 min，穿刺点压迫止血20 min，向患者交代注意事项。

FNA 结果根据Bethesda 诊断系统分为：Ⅰ类，标本无法诊断；Ⅱ类，良性病变；Ⅲ类，意义不明确的非典型病变；Ⅳ类，滤泡性肿瘤；Ⅴ类，可疑恶性肿瘤；Ⅵ类，恶性肿瘤。

1.2.2 BRAF V600E检测 取FNA洗脱液标本，采用标准酚-氯仿抽提法提取DNA溶液。PCR扩增BRAF第15号外显子，引物序列设计为正向引物，5'-ACTCTTCA TAATGCTTGCTC-3'，反向引物，5'-TAGTTGAGACCTTC AATGAC-3'，扩增片段长度275 bp。所有扩增片段经电泳证实后，进行测序。BRAF V600E基因检测结果分为野生型和突变型。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析，以术后病理学结果为“金标准”，计数资料的比较采用χ2检验。，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

130 枚穿刺标本结果中，术后病理学检查PTC 120枚，良性10枚。标本不能诊断或不满意3枚（1枚术后诊断为良性，2枚诊断为PTC）、良性病变9枚（术后诊断为良性8枚，恶性1枚）、意义不明确的非典型病变1枚（术后诊断为良性）、可疑恶性肿瘤19枚（术后诊断均为恶性）、恶性肿瘤98 枚（术后诊断均为PTC），见表1。

BRAF V600E基因突变检查结果：野生型27枚（术后诊断良性10枚，PTC 17枚），突变型103枚（术后诊断均为PTC）。术后病理证实：恶性120 枚，良性10 枚。BRAF V600E突变率79.2%（103/130），见表2。

表1 甲状腺结节细针穿刺细胞学结果和术后病理学结果 枚

表2 BRAF基因检测结果和术后病理学结果 枚

细胞学诊断的敏感度和准确度分别为81.7%和83.1%。洗脱液BRAF V600E基因检测的敏感度和准确度分别为85.8%和86.9%。BRAF 基因检测联合FNA 将细胞学穿刺的敏感度由81.7%升至92.5%（P＜0.05），准确度由83.1%升至92.3%（P＜0.05），差异具有统计学意义（表3）。

不同直径结节细胞学诊断结果：结节直径≤5 mm的细胞学诊断中，无法诊断及可疑恶性比例（10/21枚）远大于结节直径6～10 mm（7/63 枚）和直径>10 mm（5/46枚）结节（表4）。结节直径≤5 mm细胞学诊断的敏感度和准确度（47.6%和52.4%）远低于直径6～10 mm（85.7%和88.9%）及直径>10 mm（73.9%和87.0%），差异具有统计学意义（P＜0.01），见表5。

表3 FNA、BRAF及FNA联合BRAF基因检测结果 枚

表4 不同直径甲状腺结节FNA结果 枚

洗脱液BRAF V600E 基因突变检测采用穿刺针中残留的组织作为标本，不同直径的结节BRAF V600E基因突变检测无显著性差异（P>0.05，表6）。

表5 FNA检测结果

表6 不同直径甲状腺结节BRAF V600E检测结果

3 讨论

FNA 作为目前评估甲状腺结节最可靠、最有价值的诊断手段之一，也是安全、方便、经济、有效鉴别甲状腺结节良恶性的微创方法，常与高分辨率彩超结合进行甲状腺结节良恶性诊断，但仍有10%～30%的结节无法明确诊断［5］。本研究中3.1%（4/130例）患者无法明确性质，其中仅50.0%（2/4 例）需要手术。粗针穿刺活检包括超声引导下的粗针活检和CT引导下经皮甲状腺结节粗针活检，可以最大限度地明确诊断、减少假阴性。但粗针穿刺活检对结节直径要求较高，要求结节直径在2 cm 以上，而且出血等并发症较多。而目前临床上微小PTC发病率逐年升高，粗针穿刺活检已不符合临床主要需求。

有研究认为穿刺准确度与可疑结节直径相关，穿刺直径越小，超声引导下定位取材越困难，但甲状腺癌灶直径是否是FNA无法确切诊断的独立因素，研究结果不一。孙永清等［9］研究认为结节大小及位置均可影响FNA的准确度。Moon等［10］认为以直径6 mm为界，直径＜6 mm穿刺的不满意发生率约20.8%。Mazzaferri等［11］认为对于直径≤5 mm结节，穿刺取材不满意度较高，不建议对直径≤5 mm结节进行穿刺。但是Zhong等［12］研究认为，FNA对不同结节大小穿刺的敏感度、特异度及准确度差异均无统计学意义。本研究发现，当穿刺结节直径≤5 mm时，单纯细胞学诊断的不确定结节数量为47.6%（10/21枚），成为影响细胞学诊断质量的一个重要因素。此外，直径≤5 mm可疑结节细胞学诊断的敏感度及准确度均远低于直径>5 mm组，差异具有统计学意义。因此本研究认为，穿刺结节直径在一定程度上影响细胞学的诊断结果。洗脱液BRAF V600E基因突变检测采用穿刺针中残留的组织作为标本，不同直径的结节BRAF V600E基因突变检测差异无统计学意义，BRAF V600E基因突变检测一定程度上降低了可疑结节直径对于穿刺准确度的影响。因此，本研究认为对于直径较小的可疑结节，有必要辅以基因检测提高诊断准确度。

BRAF V600E基因突变作为PTC中最常见的遗传学突变［13-14］，通过突变导致BRAF蛋白激活，直接引起下游MEK蛋白磷酸化，最终导致MAPK信号途径持续激活，从而引起细胞过度增殖、分化及肿瘤的发生，已经被作为PTC诊断及预后的一个重要指标应用于临床。BRAF V600E基因突变对PTC具有高度特异度，鲜见在滤泡癌、腺瘤或良性肿瘤中发现的报道［15-16］，其特点使其成为FNA辅助病理分子诊断的一个重要工具，被作为PTC诊断及预后的一个重要指标应用于临床。本研究中，BRAF V600E基因突变103例，术后病理证实均为甲状腺乳头状癌，特异度达100%，体现了BRAF V600E基因的高度特异度。但未检测到BRAF V600E基因突变时，不能排除甲状腺乳头状癌的诊断。本研究中，BRAF V600E基因突变野生型27例，术后病理证实PTC 17例，良性10例，因此对于基因突变野生型结果的判读应当慎重。对于穿刺无法明确性质且BRAF V600E基因为野生型的患者，本研究建议患者定期随访或者3个月后重复穿刺。

Zhao 等［17］和Brown 等［18］研究均认为，BRAF 基因检测联合FNA 细胞学检查大幅提高了穿刺的敏感度。Zatelli等［19］研究认为BRAF V600E基因突变分析提高了细胞学诊断的敏感度（由77%升至87%）。本研究中，穿刺洗脱液BRAF基因辅助检测将FNA的敏感度由81.7%提升至92.5%，诊断的准确度由83.1%提升至92.3%，印证了BRAF 基因检测联合FNA 细胞学检测能提高穿刺穿敏感度和准确度的观点。本研究敏感度的显著提高主要来源于细胞学诊断中诊断不明确的结节（意义不明确的非典型病变及标本无法诊断），BRAF V600E 基因突变检测帮助制定明确的手术计划，避免不必要的手术范围，同时帮助减少其他不必要的检验，如重复穿刺。因此，对于诊断不明确的结节行BRAF V600E 基因检测对于患者的诊断和治疗十分有意义。

FNA联合洗脱液BRAF V600E基因突变检测，弥补了细胞学诊断受细胞量、细胞形态、阅片经验等因素的影响，借助洗脱液BRAF V600E 基因突变检测，通过测定BRAF V600E 基因在可疑结节中的表达情况，有助于提高甲状腺结节良恶性鉴别的准确度，指导甲状腺癌的风险分层及预后评估，提供治疗的决策信息（是否手术及手术范围的大小）［20］，且洗脱液BRAF基因检测不需要额外的穿刺标本，通过FNA标本即可检验，同时又可降低标本采集及制片等影响因素的干扰［21］。

综上所述，洗脱液BRAF V600E基因突变检测作为FNA 的有效诊断手段补充，提高了穿刺的敏感度和准确度。尤其对于穿刺结果中意义不明确的结节，可以辅助联合BRAF V600E 基因突变检测，以提高诊断的准确度。