结直肠癌中KRAS基因突变与SETDB1表达的相关性及临床意义*

陈芊杏 段芳蕾 尹涛 周剑 李霞斌 刘云 胡佳佳 孙兴旺

结直肠癌在中国居癌症发病率第3位，死亡率第5位［1］。约1/2结直肠癌患者存在RAS基因突变，其在人体内有三种亚型，即KRAS、NRAS 及HRAS，其中KRAS基因突变最常见［2］。Moon等［3］报道KRAS基因突变可激活Wnt/β-Catenin 信号通路促进肿瘤发生。SETDB1（set domain bifurcated 1）是一种组蛋白甲基转移酶，Kim 等［4］报道SETDB1 通过Wnt/β-catenin 通路调节结直肠癌的发生。但结直肠癌中KRAS 基因突变与SETDB1是否存在相关性，目前仍不清楚。本研究初步探讨了SETDB1在KRAS基因突变型结直肠癌中的表达情况及其与临床病理参数的关系，以期为研究结直肠癌的发生机制提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

收集2017年1月至2017年12月于西南医科大学附属医院接受诊治的159 例结直肠癌患者的癌组织及癌旁组织（距肿瘤边缘>5 cm 处）标本以及临床资料。纳入标准：1）经术后病理学检查确诊结直肠癌；2）术前未行新辅助治疗；3）临床病例资料完整；4）患者或其家属知情同意。排除标准：1）除结直肠癌以外，同时合并其他器官肿瘤病史；2）临床病例资料缺失。根据上述标准，共122例纳入研究。本研究通过西南医科大学附属医院临床试验伦理委员会批准（编号：KY2019061）。

1.2 方法

1.2.1 仪器和试剂 组织DNA 提纯试剂盒QIAamp®DNA FFPE Tissue Kit（购自德国Qia⁃gen公司）；DNA 扩增文库Ion AmpliseqTMLibrary Kit 2.0、Ion PIT⁃MTemplate OT2 Kit v3、Ion PITMHi-QTMSequencing 200 Kit（美国Life Technologies公司）；Nuclease⁃Free Water（美国Life Technologies公司）；DA8600基因测序仪（中山大学达安基因股份有限公司提供）；SETDB1鼠抗人抗体（美国Bioworlde公司）；EDTA抗原修复液、DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.2.2 基因检测 分别取新鲜癌组织及癌旁组织50～100 mg 捣碎，按QIAamp®DNA 提取试剂盒说明书，提取DNA。采用Qubit 3.0荧光剂检测DNA浓度，浓度在2 ng/mL 以上为合格。采用Ion AmpliSeqTMLi⁃brary Kit2.0 构建文库DNA。采用NGS 检测技术，DA8600 高通量检测仪进行KRAS 基因第2、3、4 外显子检测。

1.2.3 免疫组织化学检测及其结果判读 石蜡组织经常规脱水、透明、石蜡包埋后4 μm 厚连续切片，采用EnVision免疫组织化学染色法染色：切片经60℃恒温烤箱烘烤过夜后二甲苯脱蜡、酒精脱水，PBS洗涤；于枸橼酸盐缓冲液（pH 6.0）中高压修复3 min，冷却至室温后蒸馏水冲洗；滴加一抗SETDB1（1:100）室温孵育4 h，PBS 洗涤后滴加二抗，室温孵育30 min；PBS 洗涤后使用显色剂DAB 显色，显微镜下观察，显色完全后蒸馏水冲洗终止显色；苏木精复染、稀盐酸分化、饱和碳酸锂反蓝、脱水、透明、封片。

结果判读：所有免疫组织化学结果由两位主治医师级别以上的病理科医师独立盲审，根据肿瘤细胞阳性比例、着色深度计分。评分标准：同一显微镜下计算肿瘤细胞阳性数，阳性细胞占肿瘤细胞的比例＜5%为0分，5%～30%为1分，31%～70%为2分，>70%为3分；按细胞着色深度评分，无着色0分，淡棕黄色1 分，棕黄色2 分，棕褐色3 分［5］。上述两项指标分数相加，0～2分为阴性，3～6分为阳性。

1.3 统计学分析

应用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析。采用χ2检验分析KRAS 基因状态、SETDB1 蛋白表达水平与临床病理参数间的关系，其中分化程度为等级变量，采用秩和检验；采用Pearson 相关检验分析KRAS基因突变与SETDB1 表达的相关性。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 KRAS基因检测情况

本研究采用NGS 二代测序技术对122 例结直肠癌标本进行检测，结果发现122 例癌组织中51 例存在KRAS 基因突变，突变率为41.8%。KRAS 基因突变主要发生在第2、3、4号外显子，其中2号外显子突变46 例（90.2%）、3 号外显子突变2 例（3.9%）、4 号外显子突变3 例（5.9%），见表1。122 例癌旁组织中均未检测到KRAS基因突变。

表1 122例结直肠癌组织标本中KRAS基因突变情况

2.2 KRAS基因状态与临床病理特征的关系

分析癌组织中KRAS基因突变状态与临床病理特征的关系，结果显示KRAS基因突变状态与肿瘤部位、术前血清CEA水平差异具有统计学意义（P＜0.05），与患者年龄、性别、肿瘤分化程度、肿瘤大小、pTNM分期、淋巴结转移等差异无统计学意义（P>0.05），见表2。

2.3 结直肠癌标本中SETDB1蛋白的表达

运用免疫组织化学法对122 例结直肠癌标本中SETDB1蛋白表达进行检测，结果显示SETDB1阳性反应产物位于细胞质及细胞质伴细胞核，着棕黄色颗粒（图1）。癌组织中SETDB1阳性99例，阳性表达率81.1%；癌旁组织中SETDB1 阳性36 例，阳性表达率29.5%。SETDB1在癌组织及癌旁组织中的表达差异具有统计学意义（χ2=65.813，P＜0.001），见表3。

表2 KRAS基因突变状态及SETDB1蛋白表达与临床病理特征的关系 例（%）

图1 免疫组织化学检测SETDB1蛋白在癌组织和癌旁组织中的表达

2.4 SETDB1蛋白表达与临床病理特征的关系

临床病理学分析表明SETDB1 蛋白阳性表达与分化程度、肿瘤大小、术前血清CEA水平差异具有统计学意义（P＜0.05），而与年龄、性别、肿瘤部位、pTNM分期、淋巴结转移等差异无统计学意义（P>0.05），见表2。

2.5 KRAS 基因突变与SETDB1 蛋白表达的相关性分析

Pearson相关分析结果显示，51例KRAS基因突变型的癌组织中，SETDB1阳性47例，阳性率92.2%；71例KRAS基因野生型的癌组织中，SETBD1阳性52例、阴性19例，阳性率73.2%。KRAS基因突变与SETDB1蛋白表达呈正相关（r=0.232，P=0.008，表4）。其中，KRAS基因主要突变类型G12D、G13D、G12V与SETDB1蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05，表5）。

表3 SETDB1蛋白在癌组织及癌旁组织中的表达 例（%）

表4 KRAS基因突变状态与SETDB1蛋白表达的相关性 例（%）

表5 KRAS 基因主要突变类型与SETDB1 蛋白表达的相关性 例（%）

3 讨论

结直肠癌发生过程中会出现原癌基因激活、抑癌基因失活、DNA修复相关基因突变、凋亡调节紊乱等一系列生物学变化，KRAS基因突变是结直肠癌发生过程中常见的基因突变［6］。KRAS基因突变使RAS蛋白无需其上游信号EGFR的激活，而与GTP持续性结合，进而持续性刺激下游信号，最终促进肿瘤发生，影响患者预后［7］。这种致癌性的KRAS 基因突变，介导超过10 种不同的信号通路，包括MAPK 通路［8］、PI3K-AKT-MTOR通路［9］、Wnt/β-Catenin通路［3］等。然而，目前针对KRAS基因突变的靶向药物尚在研发中，因此，探讨KRAS 基因突变在结直肠癌中的作用机制及临床意义仍非常重要。

本研究结果提示，KRAS基因在结直肠癌组织中的突变率为41.8%，右半结肠KRAS 基因突变率高于左半结肠。目前研究者普遍认为，左半结肠癌与右半结肠癌应被视作不同的疾病。右半结肠分别起源于中胚层的后肠和中肠，右半结肠更可能出现CpG岛甲基化和微卫星不稳定性及BRAF基因突变，而左半结肠更多的出现APC 基因、TP53 基因的突变［10-11］。因此，KRAS基因突变在左半结肠、右半结肠的差异，可能分别与其胚胎起源不同有关。本研究检测到在结直肠癌中KRAS 基因突变与术前血清CEA 水平有关。CEA 被广泛用于结直肠癌术后复发转移监测及预后评估，它是由结肠、直肠组织产生的一种酸性糖蛋白，在肿瘤发展中参与细胞间黏连［12］。Yoo 等［13］的研究中发现，在结直肠癌细胞中，CEA高水平表达与RAS基因的活化相关。本研究结果也提示KRAS 基因在术前血清CEA 阳性患者中突变率更高，表明术前血清CEA 水平高的患者可能预示着KRAS基因突变的存在，这种预测可能为指导患者的靶向治疗提供帮助。

SETDB1是一种组蛋白H3K9甲基转移酶，其在肝癌、非小细胞肺癌、肾癌、乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、胶质瘤等多种肿瘤组织中高表达［14-16］。Sun等［17］研究表明，在非小细胞肺癌中SETDB1可通过调节WNT通路信号传导促进肿瘤发生。Kim等［4］研究发现，下调SETDB1可抑制Wnt/β-catenin通路信号传导，进而抑制结直肠癌的发生。Moon等［3］报道KRAS基因突变后上调其下游ERK通路，进而激活Wnt/β-catenin通路信号传导，从而诱导结直肠癌细胞中的肿瘤干细胞标志物表达。KRAS基因及SETDB1均通过Wnt/β-catenin通路介导肿瘤的发生发展，然而，KRAS基因突变与SETDB1表达是否相关联，目前鲜见相关报道。本研究显示，KRAS基因突变与SETDB1蛋白表达呈正相关，两者可能通过Wnt/βcatenin通路相互调节，其具体作用机制尚需进一步研究。二代测序结果表明KRAS基因主要突变类型为G12D（41.2%）、G13D（23.5%）、G12V（15.7%），SETDB1蛋白阳性表达可能与这些突变类型相关，本课题组下一步将扩大样本量以进一步验证统计分析结果。

本研究进一步分析了SETDB1 蛋白表达与临床病理特征的关系，发现SETDB1蛋白阳性表达与分化程度、肿瘤大小、术前血清CEA 水平相关，提示SET⁃DB1 可能参与肿瘤的分化、增殖等。Beyer 等［18］的研究表明，SETBD1在细胞分化中起着重要作用。Chen等［19］研究表明，过表达SETDB1可促进结直肠癌细胞的增殖。SETDB1可能在结肠癌中起癌基因的作用，但目前仍需进一步研究以阐明其作用机制。

综上所述，本研究结果显示KRAS 基因突变与SETDB1蛋白相关，KRAS基因突变与SETDB1的具体作用方式需更多证据证明。本研究结果为结直肠癌发生的分子机制提供了新的依据。