p28GANK 蛋白表达与肝癌发病的相关性分析＊

崔中锋，张 莹，姜 瑜

临床流行病学 统计显示，作为全球第五大恶性肿瘤和常见消化系统恶性肿瘤， 原发性肝癌（primary liver cancer，PLC）在我国的发病率不断升高，其恶性程度高，预后差，致残率、病死率高。 目前， 关于PLC 的分子机制研究尚有待完善。p28GANK 为含有226 个氨基酸的蛋白 （分子量为25kDa）， 在 临 床 上 又 将 其 称 为P28GANK 或PSMD10。 p28GANK 最初由日本学者Fujita 等在人肝癌细胞中通过cDNA 文库经消减杂交法克隆得到，并被认为是一个肝癌差异表达基因，能够介导蛋白质之间的相互作用，发挥多种生物学功能［2］。随后有 文献［3-5］逐渐证实，p28GANK 蛋白的表 达水平与PLC、食管癌、胰腺导管癌等患者的病理特征及预后相关，但该基因促进PLC 发生、发展的作用机制目前尚未完全阐述清楚。 为此， 该文重点分析p28GANK 蛋白表达情况与PLC 发病相关性及其可能作用机制。

1 资料与方法

1.1 病例资料 收集2015 年3 月—2018 年3 月笔者所在医院肿瘤科行手术切除治疗并经病理证实的48 例PLC 患者的蜡块组织标本，其中有28 例患者术中取得癌旁组织（选取标准为距离肿瘤包膜≥5 cm）。 所有标本经10%甲醛溶液固定及石蜡包埋，切片厚4 μm。 病例纳入标准：（1）符合卫生部颁布的《原发性肝癌诊疗规范》（2011 年）［6］中相关诊断标准；（2） 肝功能按照Child 分级分为 A、B、C 级；（3）术前未经任何放化疗或介入治疗；（4）入选患者或其家属均对该研究的目的和意义知情，并签署知情同意书。 排除标准：（1）诊断为各种继发性肝癌及门静脉主干癌栓阻塞；（2）骨髓、肾和心脏功能严重受损或不全；（3）合并其他肿瘤疾病、严重感染、内分泌疾病、免疫疾病、精神或神经系统疾病；（4）临床病历与随访资料不全。 48 例PLC 患者中， 男27例，女21 例；年龄42～76 岁，平均（57．28±10．10）岁；最大肿瘤直径＜5 cm 者27 例，≥5 cm 者21 例。 按照美国肿瘤联合会（American Association of Cancer，AJCC）［7］制定的肝细胞肝癌分期：Ⅰ～Ⅱ期29 例、Ⅲ～Ⅳ期19 例，肝功能分级：A 级16 例、B 级22 例、C级10 例，伴淋巴结和（或）远处转移者19 例。 该研究符合该院伦理委员会及卫生部《涉及人的生物医学研究伦理审查办法》的相关规定。

1.2 免疫组织化学法 均采用免疫组织化学S-P法染色法，获取的组织切片常规脱蜡、水化处理后，置入3%过氧化氢溶液中并于室温下孵育30 min 以阻断内源性过氧化物酶，正常非免疫羊血清（福州迈新生物技术开发有限公司）置于室温封闭30 min，滴加兔抗人p28GANK 单克隆抗体 （Santa Cruz 公司），浓度为1∶50，于密封湿盒中4 ℃过夜，滴加生物素标记二抗（即用型）与标记过氧化物酶的链霉菌抗生物素蛋白 （福州迈新生物技术开发有限公司），应用DAB 显色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），苏木素（Sigma 公司）复染及中性树胶封片。

1.3 p28GANK 蛋白表达评判标准 结果评估参照文献［8］的方法，以已知阳性的结肠腺癌切片做阳性对照， 阴性对照以磷酸缓冲盐溶液代替一抗，由该院两位医师在不明确患者临床病理资料的情况下进行显微镜下观察，p28GANK 免疫组织化学染色阳性物质定位于细胞质和（或）细胞核。 每例患者的组织标本随机观察3 个视野（×200），以阳性细胞比例与染色强度判定染色结果。 无阳性细胞、阳性细胞＜30%、阳性细胞30%～60%、阳性细胞＞60%分别记0、1、2、3 分；无染色、弱阳性染色、阳性染色、强阳性染色分别记0、1、2、3 分；两项评分分值之和0～2 分为p28GANK 表达阴性、3～6 分为阳性。

1.4 凋亡基因表达检测 同样采用以上方法（免疫组织化学S-P 法染色法）评估每例患者组织标本中凋亡相关基因Bcl-2、Bax 的蛋白质表达水平，其中即用型Bcl-2 鼠抗人单克隆抗体、Bax 鼠抗人单克隆抗体均购自福州迈新生物技术开发有限公司，结果同样以阳性细胞比例与染色强度判定染色结果。

1.5 统计学方法 选用统计学软件SPSS19．0 分析和处理研究数据，计数资料采用%表示，不同病理组织p28GANK 蛋白表达阳性率及Bcl-2、Bax 蛋白表达阳性率对比采用χ2检验；p28GANK 蛋白表达与Bcl-2、Bax 蛋白表达的相关性采用Spearman 等级相关系数进行评价；PLC 组织p28GANK 蛋白与临床病理特征关系均采用χ2检验； 以P＜0．05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 p28GANK 蛋白及凋亡相关基因表达情况 组织中p28GANK 蛋白阳性表达多表现为棕黄色细小颗粒，定位于细胞核和细胞质；Bcl-2、Bax 蛋白的阳性产物亦为棕黄色颗粒，定位于细胞质中；见图1。PLC 组织中p28GANK 蛋白及Bcl-2、Bax 蛋白阳性表达率均明显高于癌旁组织（P＜0．05），见表1。

2.2 p28GANK 蛋白表达与Bcl-2、Bax 蛋白表达的相关性 PLC 组织中p28GANK 蛋白表达阳性的36 例患者中29 例Bcl-2 蛋白表达阳性，而仅24 例Bax 蛋白表达阳性，Spearman 等级相关分析显示，PLC 组织中p28GANK 蛋白与Bcl-2 蛋白阳性表达存在相关性，且差异具有显著性（r=0．353，P＜0．05），而与Bax 蛋白阳性表达的相关性不具有显著性（r=0．095，P＞0．05），χ2值比较见表2。

2.3 p28GANK 蛋白表达与病理特征的关系 不同性别、年龄、最大肿瘤直径、肝功能分级的PLC 患者组织p28GANK 蛋白阳性表达率无显著性差异（P＞0．05），但Ⅲ～Ⅳ期患者组织p28GANK 蛋白阳性表达率高于Ⅰ～Ⅱ期患者， 有淋巴结或远处转移的患者组织p28GANK 蛋白阳性表达率高于无淋巴结或远处转移的患者，且差异具有显著性（P＜0．05），见表3。

图1 PLC 组织、癌旁组织p28GANK 蛋白及Bcl-2、Bax 蛋白表达示例（×400）

表1 p28GANK 蛋白及凋亡相关基因表达情况［例（%）］

表2 p28GANK 蛋白表达与Bcl-2、Bax 蛋白表达的关系（例）

表3 p28GANK 蛋白表达与病理特征的关系

3 讨 论

关于PLC 的发生、发展诱因尚为临床研究的热点问题， 目前已明确其与HBV、HCV、 黄曲霉毒素B1 等致癌因子引起的癌基因变化有关，例如N-ras基因、C-myc 基因、C-fos 基因的激活与p53 抑癌基因的失活等［9］。 由于p28GANK 是通过肝癌cDNA文库消减杂交法获得的相关基因，近年来对于其在肝癌中的研究逐渐受到关注。 Iwai 等［10］的早期肝细胞再生研究显示，p28GANK 过表达发生于肝细胞再生的初期， 其表达相与细胞周期蛋白D1 上调及Rb 蛋白下降类似，提示p28GANK 有助于促进肝细胞再生。 分子机制报道［11］显示，p28GANK 基因主要通过Rb、 鼠双微基2 及p53 等信号途径实现对细胞周期进程的调控、促进细胞的增殖及抑制细胞凋亡， 提示p28GANK 基因可能在细胞增殖和肿瘤发生发展中具有极为重要的作用。 李世杰等［12］的结果显示，PLC 患者经动脉化疗栓塞后残余肝癌细胞中p28GANK 蛋白表达水平高。 该次研究结果显示PLC 组织中p28GANK 蛋白及Bcl-2、Bax 蛋白阳性表达率均明显高于癌旁组织， 提示p28GANK 蛋白表达与PLC 的发生发展有关。

相关学者认为，p28GANK 促进肿瘤恶性进展的可能机制体现在： 三维晶体结构p28GANK 分子表面有凹槽，可与其他分子相互作用，继而实现多种复杂的生物学功能， 如Rb 蛋白能够调节肿瘤细胞增殖、凋亡等恶性生物学行为，p28GANK 上具备与Rb 相互作用位点， 可通过26S 蛋白酶体的S6b腺苷三磷酸酶来降解Rb， 或者直接与26S 蛋白酶体20S 核心结合介导其自我降解；p53 通路在肿瘤发生、发展中扮演了重要的角色，而p28GANK 可与MDM2N-端RING 结构域结合激活后者引起构象变化，继而促使p53 泛素化及降解，间接促进细胞增殖与抑制细胞凋亡［13，14］。该研究Spearman 等级相关分析显示，PLC 组织中p28GANK 蛋白与Bcl-2 蛋白阳性表达存在明显的相关性（r=0．353），而与Bax蛋白阳性表达不相关 （r=0．095），Bcl-2 和Bax 一对凋亡因子，前者可抑制凋亡，而后者主要促进凋亡，二者通常用于反映肿瘤细胞的生长状态，尤其是作为人类滤泡性淋巴断裂点发现的癌基因，凋亡抑制因子Bcl-2 蛋白的过度表达可起到抑制肿瘤细胞凋亡的作用［15］。 该研究结果表明高p28GANK 蛋白表达可能通过上调凋亡抑制基因Bcl-2 的表达而影响肿瘤侵袭与转移， 推断可能机制为p28GANK与Bcl-2 均可通过作用于细胞凋亡的不同阶段而发挥协同抗凋亡效应， 从而促进PLC 的发生与发展； 而p28GANK 与Bax 可能通过不同途径作用于凋亡过程，因而二者阳性表达不具有相关性。

此外，莫瑞祥等［16］的报道认为p28GANK 蛋白过表达与PLC 的多项病理参数具有密切关系，本研究统计分析发现，不同性别、年龄、最大肿瘤直径、肝功能分级的PLC 患者组织中p28GANK 蛋白阳性表达率无明显差异， 但Ⅲ～Ⅳ期患者组织p28GANK 蛋白阳性表达率明显高于I～Ⅱ期患者，有淋巴结或远处转移患者组织p28GANK 蛋白阳性表达率明显高于无淋巴结或远处转移的患者，进一步证实p28GANK 蛋白过表达可促进PLC 的恶性进展，尤其是肿瘤侵袭与转移，可能与高p28GANK蛋白表达影响凋亡抑制基因Bcl-2 的表达有关，但p28GANK 与Bcl-2 的相互作用仍有待进一步阐明。