纤维素降解酶研究进展

王晓涛，魏佩玲，胡 波，宫 平（新疆畜牧科学院，乌鲁木齐 830000）

当前地球上面临着环境、食品、能源等多方危机，刺激了社会对可再生资源的利用需求。纤维素是一种广泛存在的可再生生物资源，主要来源于种植园的农作物，此外来自谷物和豆类油性种子的木质纤维素残渣数量也十分丰富[1]。这些不能被动物直接利用的木质纤维素如果能够转化为可被利用的物质，将对于工业和农业经济的发展有极大的价值。目前物理法、化学法和生物学方法是主要的纤维素原料转化生产方式，物理法和化学法由于对环境有污染且生产工艺复杂、成本相对高昂而在实际应用中有所限制。所以使用生物法—即利用纤维素降解酶是当前利用纤维素资源的研究热点。

迄今为止，纤维素酶在商用上已超过30年，具有广泛的来源，在工业上其主要来源是具有降解木质纤维素能力的微生物。虽然纤维素酶的降解机制尚未完全明确，但纤维素酶已在各个行业广泛应用并被认可。本文总结了目前纤维素酶的来源、分类、降解机制以及活力测定方面的研究结果，在此基础上探讨了纤维素酶在生产应用中需要解决的问题，并且对纤维素酶的实际应用潜力进行了总结和展望，期望为进一步探索高效、经济、环保的纤维素酶提供研究依据。

1 纤维素酶的来源

纤维素酶的来源广泛，目前在反刍动物瘤胃、动物肠道、植物和昆虫体内都有获得纤维素酶的报道[2]，但由于这些来源的提取成本和技术等问题鲜少被研究并运用到实际生产中，因此，目前仍是以多种能产生纤维素降解酶的微生物为研究重点，其中包括真菌、细菌、放线菌。其中放线菌由于纤维素酶的产量极低而很少被研究。由于真菌和细菌可产生能够广泛溶解结晶纤维素的高活性胞外纤维素酶，并且有的真菌和细菌能同时产生降解够结晶纤维素所需的全部三种纤维素酶[3]，因此而被广泛研究。虽然目前分离鉴定了多种能产生纤维素降解酶的菌株，但其中只有很少菌株能产生达到工业应用要求的酶活的纤维素酶[4]。

1.1 真菌

相对细菌而言，真菌能够分泌更多的胞外纤维素酶到培养基中并且对酶液进行分离纯化也更容易，因此对于工业生产来说更易于操作。此外真菌的糖苷纤维素酶没有细菌复杂，所以可以通过基因重组在增殖迅速的大肠杆菌上表达来提高产酶效率。目前商用的纤维素酶大多来自一些瘤胃厌氧菌、里氏木霉以及白腐菌等担子菌。里氏木霉因其能产生酶谱全且活力高的纤维素酶，所以50多年来对该真菌产纤维素酶能力的研究更为完善。但有研究表明大多数真菌所产生的纤维素酶为酸性，这类酶对于碱性环境不耐受且处于高温环境下会失活。因此，对于这些酸性纤维素酶应当进行分子改造，提高其适应pH范围。

1.2 细菌

当前普遍认为真菌是更好的纤维素酶生产者，这可能与很少直接研究比较细菌来源和真菌来源的纤维素酶有关，但两者其实各有其实际应用价值。由于真菌普遍需要氧气才能生长且所产基本为耐酸纤维素降解酶，因此在一些含氧较少或需要中性或碱性纤维素降解酶的工业生产过程中，芽孢杆菌、乳酸杆菌等细菌来源的纤维素酶的研究在生产应用上就具有较大的经济价值和现实意义。如最近发现贝莱斯芽孢杆菌ZY-1-1基因组含有纤维素和木聚糖酶降解基因，并且该菌株产这两种酶能力很强[5]，来源于枯草芽孢杆菌BTN7A的β-1,3-1,4葡聚糖内切酶具有很强的酶活性[6]。

目前许多需氧菌和厌氧菌都被证明能产生纤维素酶，对此研究更多的是这两者在生物降解时所表现的纤维素酶系统的差异。微生物所表现的纤维素酶的生产能力在温度、pH和其他多种因素不同的情况下具有很大差异，这也提示了自然环境中纤维素酶的广泛可得性，同时为将来利用这些不同来源不同性质的纤维素酶基因的优化条件提供了研究基础。

1.3 极端微生物

由于最近在利用纤维素降解的生物燃料和生物能源的生产过程中，需要根据特殊的工业需求进行不同的预处理，因此，对于产纤维素酶的微生物要求能够能耐受极端的环境，如高温，强酸强碱等。近年来在对极端微生物来源的纤维素降解酶的研究中也发现了很多能产纤维素酶的极端古细菌[7]。目前已有从诸如高山、极地、温泉等极端的环境中分离出具有产纤维素酶能力的微生物。王继莲等从东帕米尔高原不伦口湖群湿地分离到一株低温纤维素酶产生菌枯草芽孢杆菌BCL2[8]；王翀等从湖南周边稻田中、易旻等从鸡粪蘑菇渣高温堆肥中分别分离到高温纤维素酶产生菌芽孢杆菌[9,10]；党佳佳等从辽河河口区芦苇湿地分离出一株高产酶的耐盐纤维素降解菌LHK-T3[11]。这些菌株的分离鉴定，为生产耐高温、耐低温和耐盐纤维素酶提供了基础。

真菌和细菌产生的纤维素酶在生产应用上各有优缺点。真菌所产的胞外酶易于分离纯化，其本身产酶率高且酶系较全面，但对环境适应性较差，更适合酸性条件下的工业应用。细菌产纤维素酶量少，且较少产生胞外酶，提纯技术要求高，由于在纺织、洗涤剂等应用上，多数需要中性和碱性纤维素酶，因此细菌产生的纤维素酶有更好的商用价值，并且在饲料工业中，需要一些耐高温的纤维素酶，因此极端细菌所产纤维素酶的潜力具有重要价值。

1.4 动物纤维素酶

研究者首次证明了蜗牛中存在内源性纤维素酶，而后从植物寄生的线虫中获得了一种内切β-1，4-葡聚糖酶的cDNA，进一步证实了动物体内内源性纤维素酶存在。目前认为环毛蚓、福寿螺、蜗牛、线虫、白蚁、文蛤、鲍鱼及天牛等物种体内都具有纤维素酶。 Watanabe等首次报道了白蚁纤维素酶的基因，证明动物有自身的纤维素内切酶[12]。Wang等在2003年首次发现了福寿螺肠道内具有多功能纤维素酶EGX[13]。王婷婷发现，文蛤内脏中存在完整的纤维素酶系，其中内切纤维素酶的活性较高，且酶活测定数据稳定性良好[14]。陶志鹏以鲍鱼为研究对象，从内脏中分离纯化出一种纤维素酶，并运用分子生物学手段克隆得到编码纤维素酶的全序列[15]。但目前从动物内脏获得的纤维素酶活性不一，因此，今后的主要研究还要继续寻找具有较高活性纤维素酶的生物物种。

2 纤维素酶的分类

纤维素酶是一种包括多种水解酶的复杂酶系，现代研究认为其主要包括3种作用各异的酶组分：

（1）内切葡萄糖苷酶（endo-1,4-β-glucanase，EG 或 CMCase）：它能水随机水解 β-1,4 糖苷键，将长链纤维素分子截断，其作用的是融解的纤维素衍生物或者膨胀和部分降解的纤维素,但不能作用于结晶纤维素。主要产物是纤维素寡糖,纤维二糖等。

（2）外切葡萄糖苷酶（exo-1,4-β-glucanase）：这类酶在天然纤维素的降解过程中起主导作用,主要作用于纤维素分子末端，水解β-1,4糖苷键，每次酶切下一个纤维二糖单位，所以也称其为纤维二糖水解酶。

（3）β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）：它的主要作用是将纤维二糖和短的纤维寡糖降解为葡萄糖，该类酶的专一性比较差。

3 降解机制

关于纤维素降解的机制尚不明确。最早提出的C1-Cx假说，其认为必须由不同类型的纤维素酶依一定的步骤作用于纤维素才能完成降解过程。此外其他被提出的还有顺序作用假说、短纤维形成假说等。但目前最被认可的是协同作用理论，自20世纪70年代首次被提出，目前所知的主要有4种典型协同作用[16]：（1）内切和外切葡聚糖纤维素酶之间的协同作用；（2）底物中还原性和非还原性末端的外切葡聚糖纤维素酶之间的协同作用；（3）内切或者外切葡聚糖纤维素酶与内切葡聚糖纤维素酶之间的协同作用；（4）β-葡萄糖苷酶与其他纤维素酶之间的协同作用。但也有研究表明不同的纤维材料中结晶区和非结晶区的比例不同，并且其他组分和物理结构上均有差异，所以水解时需要的纤维素酶比例也会不同[17,18]。

迄今为止，人们对纤维素酶分类和作用机理的认识程度表明，高效利用纤维素的关键在于正确结合每个纤维素酶活性作用关系以及提高其生产水平，任何一种纤维素酶在工业生产上都具有相应利用价值。

4 纤维素酶的活性测定

不同类型纤维素酶的活力测定都有其特定的测定方式。目前有单独酶活力和总酶活力的测定方法[19,20]。但目前对纤维素酶活性测定没有统一标准，并且评价方法不规范[21]。对于测定酶活力的条件也尚未有统一的标准。

目前国内测定纤维素降解酶方法是以纤维素酶水解纤维素产生的还原糖量作为酶活力标准，常利用3,5-二硝基水杨酸（DNS）来进行测定。但DNS法的结果可能会受其试剂新鲜度、反应条件、滤纸裁剪方法等影响，对所测酶活力值有一定的影响，DNS试剂用量在1～3 mL范围时所测得的酶活力值与其用量成反比[22]，邵锦挺等人对微型化DNS法进行了研究，提高了DNS测定方法的准确性[23]。

羧甲基纤维素钠糖化法常用于内切葡聚糖酶的活力测定。但生产厂家的不同也会对酶活力结果产生影响，顾赛红等人[24]通过对此的研究表明酶活力测定的灵敏度与羧甲基纤维素钠的品质有关，其浓度最适范围是在0.1～0.4吸光度。外切葡聚糖酶的活力测定有两种不同的底物，分别为对硝基酚纤维二糖和微晶纤维素，前者有一定特异性，但需结合抑制剂来抑制β-葡萄糖苷酶的进一步水解，后者则需要先进行复杂而高昂的提纯步骤后才能确实反映其单一酶活力。β-葡萄糖苷酶的活力测定一般可采用分光光度法、荧光法和比色法[25]，根据方法不同其底物也相应不同，但一般选用纤维二糖作为底物。目前，总纤维素酶的活力测定一般采用滤纸片降解法，将具有中等聚合度与结晶度的滤纸选作反应底物，测定底物产生量。但由于尚未有滤纸质量的严格标准，其结构、结晶度、淀粉含量等会因厂家不同而存在差异，对最终特定条件下单位时间降解所生成的单糖量结果有所影响。国际上曾将Whatman1号滤纸作为统一底物，但国内仍未统一[26]。对高活性纤维素酶的初筛阶段常采用滤纸崩解法和透明圈法。滤纸片崩解法，即将滤纸片作为底物，加入纤维素酶后，计算纤维素酶将滤纸片完全降解所需要的时间。时间越短，纤维素酶活性越高。反之，活性越低。目前该方法也得到改良，通过测定纤维素酶酶解产物中葡萄糖的含量，准确地计算出纤维素酶的活性。虽然方法精准，但是耗时长[27]。透明圈法中透明圈和菌落直径的比值作为相对酶活的大小。但其受不同温度、时间、pH、底物浓度、碳氮比例、离子浓度、表面活性因子等条件的影响，所以所观察到的结果仅能作为其存在纤维素酶或可利用纤维素的初步判断依据[28]。纤维素酶活测定中对于酶活定义以及针对不同酶活力测定的底物、实验材料和实验步骤的统一对于横向比较目前已有的纤维素酶降解能力以及对于未来筛选和优化高酶活的纤维素酶都具有重大价值。

5 基因工程技术生产纤维素酶

近年来也有许多相关研究尝试利用生物工程技术将纤维素降解微生物的酶基因在大肠杆菌及酿酒酵母上表达以获取活性更高、产率更大、酶系更完整或具有特殊活性的纤维素酶。研究报道，利用大肠杆菌BL21（DE3）成功表达出了融合纤维素酶Cel42-Cel22[29]和内切β-1,4-葡聚糖酶基因[30]；利用乳酸菌表达来源于多粘类芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶基因bglA、bglB及内切β-葡聚糖酶基因[31]；利用毕赤酵母表达Endo2基因获得一种新型耐高温内切葡聚糖基因[32]。但利用基因工程技术表达出来的酶数量少，活性不定，在工业生产上还要进一步优化菌株培养条件和产酶条件。

6 应用与展望

纤维素酶目前被广泛作为降解纤维素的环境友好型生物酶类应用于各个领域，特别是在纺织、造纸、畜牧、食品、能源等方面具有极大的市场需求量。最初纤维素酶被应用于纺织工业中来调整织物的特性和品质以符合人们需求[33]。在造纸工业中则被用以处理纸张纤维成纸性能、改善纸浆性能以及将废纸脱墨以便循环利用[34]。酸性纤维素酶在畜牧行业中利用较为广泛，是目前研究重点。饲料中添加纤维素酶可以提高饲料消化利用率，提高饲料营养价值，并且能够预防和治疗一些家畜胃肠疾病[35,36]。在食品工业中主要被应用于发酵处理食品，提高加工果蔬汁和酒时的产出率，并且也被应用于食醋和酱油的酿制[37]。其他有所报道的应用有：在结合纤维素酶处理烟草提高其品质，提高人参有效成分提取率，在洗涤剂中应用时能在去污的同时对织物有增色和柔化的效果，此外在石油工业的洗井和植物遗传转化育种方面的应用也有报道。而在能源和环境保护方面，目前经纤维素酶对自然界广泛存在的纤维素进行生物转化所得的生物乙醇是被普遍看好的新型燃料，目前正在积极探索其在能源生产领域方面的研究。因此，纤维素酶在工业和农业上都是具有市场潜力的酶。

由于生产加工工艺和生产效率等多方面的问题，目前纤维素酶在实际应用仍有很多问题函待解决。当务之急是更深入研究相关纤维素酶的作用机制，调整不同组分比例以适应不同工业应用需求，统一酶活性测定标准并开发和优化不同环境下具有高酶活的纤维素酶，改善当前的生产技术水平降低生产成本，以满足市场对可持续发展的新型酶制剂的需求。