雌性骆驼繁殖研究进展

哈斯高娃，乌日罕，伊茹汗，唐斯嘎，韩乌兰图雅，娜仁花

（1.内蒙古农业大学 动物科学学院，呼和浩特 010018；2.内蒙古自治区动物遗传育种与繁殖重点实验室，呼和浩特 010018）

几个世纪以来，骆驼一直是沙漠地区的重要动物，大型和小型骆驼科动物在干旱地区或高原地区上发挥着重要作用。因为它能够在严酷、炎热以及干燥的环境中提供奶，肉类以及运输。骆驼科包含旧世界骆驼属和新世界骆驼属，旧世界骆驼包括两种：单峰骆驼和双峰骆驼[1]，新世界骆驼属分为驼羊、羊驼、原驼和骆马[2]。单峰骆驼在北非、阿拉伯和南亚的炎热干燥气候的环境中生长，而双峰骆驼在更寒冷的地区发现，如俄罗斯南部、中国和蒙古。骆驼生长缓慢，比其他牲畜物种更晚到达青春期,双峰骆驼母驼3岁性成熟。公、母骆驼混群放牧时，4岁的母骆驼才能产羔。适宜的配种年龄为4～5岁，繁殖年龄为18～20岁。母骆驼发情期集中在冬、春两季。 发情期在12月下旬到第2年1月中旬[3]，骆驼的妊娠期为390 d，平均出生体重35～40 kg[4]。骆驼在天然牧场条件下的繁殖效率很低，也是影响骆驼生产力的重要因素之一。繁殖效率低的原因包括繁殖季节相对较短，进入青春期比较晚和13个月的长妊娠期。骆驼的繁殖寿命比其他物种长，并且其生育能力会随着年龄的增长和因为发病而下降。

1 骆驼卵巢卵泡动力学

对卵泡生长阶段精确的定义有助于更好了解家畜生殖周期。骆驼是诱导性排卵动物,在非怀孕的生殖周期中没有黄体[5]。其排卵是在交配后24～48 h后开始的。在繁殖季节，骆驼卵巢卵泡的生长和发育以及卵母细胞的产量都较高，小、中、大卵巢以及卵巢卵泡总数在繁殖期间高于非繁殖季节[6]。在成年骆驼中，卵巢具有蚕豆的形状，长2 cm，宽1.5 cm。 子宫是双角的，但与其他反刍动物不同的是，因为子宫角短，缺乏典型的子宫子叶[7]。骆驼不育的最常见原因是卵巢发育不全，病情可能是单侧或双侧卵巢发育不全，卵巢双侧发育不全的骆驼将没有原始卵泡，因此是没有生育功能的[8]。据Smesbah等人报道，单峰骆驼的每个卵巢的卵泡平均数（±SD）是11.57±7.45，小于4岁为9.11±5.74，大于4岁为12.18±7.72。每个卵巢2～4 mm卵泡的平均数量在小于等于4岁时为8.75±5.80,大于4岁时的单峰骆驼卵巢卵泡数为11.67±7.38[9]。单峰骆驼卵巢卵泡波可为四个阶段，招募阶段、生长阶段、成熟阶段以及回归阶段。在招募阶段平均招募12个卵泡。卵泡的生长阶段是卵泡招募后进行，3～6个卵泡长到约8 mm直径 （持续时间：6.10±0.15 d）。成熟阶段由一个或两个生长的卵泡成为优势卵泡（持续时间：10.20±0.47 d）时开始，并在优势卵泡（DF）失去其优势并排卵，下一个卵泡波出现时结束[10]。

评估雌性骆驼的卵巢状况可以通过直肠触诊或通过超声检查。早先在单峰骆驼中了解卵泡波模式是基于少数动物的验尸检查和直肠触诊。据研究结果报告，在非交配情况下优势卵泡的寿命，即从卵泡首次出现时到卵泡消退时的天数为，印度的17～23 d[11]，埃及24 d[12]，在苏丹28 d[5]。在双峰驼中，平均优势卵泡寿命为19 d（14～21 d）[13]。在驼羊中，小卵泡每天生长0.5～1.0 mm，直到它们直径达到1.0 cm，然后通常只有一个卵泡继续生长成为优势卵泡，而其他卵泡则会退化[14]。在单峰骆驼和双峰骆驼中，优势卵泡的平均最大直径为2.0±0.1 cm，但在单峰骆驼的大约50%的发情周期中，优势卵泡继续生长至直径为4.2±0.2 cm[15]。这包括从形成优势卵泡并且能够排卵，到没有交配时的时间，它开始退化。

将雌性骆驼与雄性一起饲养，当优势卵泡的直径为1.3±0.2 cm，小于非交配骆驼的1.5～2.5 cm优势卵泡时，它们通常会交配[16]。在交配的骆驼中，通过快速检测，排卵交配后28～36 h内成熟卵泡消失。可以鉴定发育的黄体（CL）在交配后第4～5 d通过超声检查的到，到第8～9 d时尺寸最大，黄体会在第9～12 d退化[17,18]。

2 骆驼卵母细胞体外培养

体外卵母细胞成熟在辅助生殖技术（ART）中起着至关重要的作用。核成熟，包括排出第一极体（1PB），细胞质成熟和卵丘细胞（CC）扩增是卵母细胞体外成熟（IVM）的标准。据报道，在繁殖季节单峰骆驼的卵母细胞的成熟率为68.2%，而在非繁殖季节卵母细胞成熟率降至44.4%[19]。Russo等人用荧光共聚焦在单峰骆驼卵母细胞中观察生物能和氧化状态，其与卵母细胞减数分裂阶段有关。在IVM后，61%的卵母细胞恢复减数分裂，36%的卵母细胞达到减数分裂II期（MII）。在生发泡（GV）阶段未成熟卵母细胞线粒体聚集体均匀分布，与GV期卵母细胞相比，MI和MII卵母细胞在皮质周管状网络（PCTN）中显示更高的线粒体分布率，MI和MII卵母细胞中的线粒体活性也增加了。MI和MII期卵母细胞的活性氧（ROS）水平也比GV期卵母细胞显著增加[20]。

据报道，骆驼卵母细胞可以在30 h的最佳培养时间内体外成熟。将培养时间从36 h延长至48 h导致卵母细胞退化。骆驼卵母细胞处于窦卵泡的生发泡阶段时，卵母细胞的成熟将处于第一次减数分裂的前期I。GVBD所需的时间从不到6 h连续到30 h[21]。据报道，在培养单峰骆驼卵丘卵母细胞时，观察到从培养的第12 h开始会排出第一极体（6.35%），在48 h期间，观察到在288个卵丘卵母细胞复合物（COCs）中排出63个第一极体（21.88%），在24 h时观察到第一极体排出最高速率（25.40%）[9]。

据报道，卵巢卵泡大小对单峰骆驼的卵母细胞质量是有影响的。Khatir等人通过体外和体内的发育能力来衡量卵母细胞质量，COCs的体外成熟（IVM），体外受精（IVF）和体外培养（IVC）后，来自大卵泡的卵母细胞卵裂率比小卵泡的更高。来自小卵泡的囊胚没有一个导致怀孕，而68%（15/22）的来自大卵泡的胚胎发育成25 d的妊娠。 在由此产生的15例妊娠中，53%（n=8）中止妊娠（5例2个月和4个月之间，3例在怀孕5～7个月之间）。 剩下的7名怀孕雌性骆驼生下了正常健康的后代（4峰雌性和 3 峰雄性）[22]。

3 雌性骆驼卵泡周期的激素水平变化

与其他骆驼科观察结果一致的是，在美洲驼中，黄体溶解始于排卵后第7 d，并在第10 d完成黄体溶解[23]。在单峰骆驼血浆中，促黄体生成素（LH）浓度在交配后1 h内增加，2～3 h后达到最大浓度3～19 ng/mL，然后在交配后6 h开始减少[18]。在双峰驼中，在交配后约4 hLH浓度约为6.9 ng/mL，然后在8 h后LH的浓度会减少[24]。在人工授精与自然交配的双峰骆驼中，排卵后雌二醇-17β的浓度立即降低，而排卵后3 d再次上升，在排卵后13 d当怀孕开始时，雌二醇浓度再次下降[25]。

Skidmore等人报道，可以通过GnRH或hCG以及自然交配诱导使单峰骆驼排卵，用促性腺激素释放激素（GnRH）或人绒毛膜促性腺激素（hCG）处理的最佳时间是当生长的卵泡直径在0.9和1.9 cm之间时[26]。

在单峰骆驼的发情周期期间，雌二醇（E2）的浓度会有一定的变化。 发情周期的长度为17.2 d，在妊娠第10个月，E2水平突然上升并持续上升至第12个月，然后激素浓度下降直至分娩当天。 非繁殖季节（5月至11月）的E2水平较低[27]。在发情周期中，随着卵巢卵泡大小的增加，雌激素与睾酮浓度也会上升，然后其浓度随着卵泡的消退而减少[28]。

随着卵泡大小的增加，卵泡液中胆固醇浓度也显著增加。卵泡胆固醇来自两个来源，即卵泡颗粒细胞中的乙酸盐和血浆中的脂蛋白[29]。颗粒细胞在其生长和增殖过程中需要胆固醇[30]。

在已怀孕的单峰驼中，携带雄性胎儿的骆驼的孕酮水平高于携带雌性胎儿的骆驼水平，而雌二醇浓度低于携带雌性胎儿的骆驼水平。由此可见，在单峰骆驼中类固醇激素水平受到胎儿性别的影响[31]。

Ararooti等人经过给单峰骆驼注射FSH、eCG-FSH和 hMG后观察其超数排卵反应，隔12～15 d注射两次GnRH类药物使单峰骆驼的卵泡波同步，在GnRH类药物处理后2 d后，每3峰骆驼组成的组，接受不同的超数排卵方案，分别使用促卵泡素（FSH），马绒毛膜促性腺激素(eCG)和FSH，人绝经期促性腺激素（hMG）对单峰骆驼进行超数排卵，每天注射两次，连续注射5 d并逐渐减少剂量，在最后一次注射的36 h后交配一次并静脉注射GnRH类药物，通过超声检查评估超数排卵后第4 d卵巢卵泡的直径和数量≥4mm，交配后第7.5 d的黄体和卵泡总数≥9 mm，观察到FSH，eCG-FSH和hMG中的黄体总数与FSH，eCG-FSH和hMG处理的单峰骆驼中扩大的孵化囊胚的数量之间没有显著差异。这项研究表明，三种超排卵方案都可以在单峰骆驼中成功使用并互相替换[32]。

4 驼卵巢囊肿

雌性骆驼的繁殖性能和不孕的原因也包括卵巢异常。Dawod等人收集非妊娠期的雌性骆驼的（n=500）的卵巢，在繁殖和非繁殖季节期间检查，粗略地测量卵巢卵泡的直径并记录卵巢异常。骆驼卵泡囊肿通常在单侧或双侧有单个或多个囊肿，大多数是单一的。 囊肿是薄壁的，血管良好或略微不透明，并充满稻草色卵泡液。 直径范围为17～40 mm。卵巢黄体囊肿则是厚壁的，变得部分或完全不透明，接近灰黄色。抽吸后卵泡液达到22 mL。黄体囊肿的大小可以达到50 mm的直径。出血性囊肿是单层，厚壁，长在卵巢单侧或双侧，并且在抽吸后含有血液卵泡液达到8 mL。直径范围为10～25 mm[33]。

卵巢卵泡、黄体和出血性囊肿是非排卵卵泡（功能性囊肿）的正常进化。 这些囊肿的存在表明排卵失败可能是由于交配后LH释放不足引起的[15]。LH释放不足可能是由于下丘脑-垂体功能紊乱或减少交配刺激的作用。

5 体外成熟以及体外受精

与其他物种一样，辅助生殖技术（ART）在骆驼科动物中也非常重要，ART可以更有效地利用优越遗传基因的雄性，帮助预防骆驼性病传播，减少动物运输的需要。体外成熟（IVM）和体外受精（IVF）的目标是产生大量优质的胚胎和这些胚胎在转移到受体动物后能够成功活产。与其他一些大型家畜相比，关于骆驼科动物的IVM和IVF的报道很少。

与其他动物物种相比，骆驼科动物的体外胚胎生产效率不高，将卵巢储存长达12 h而不会对体外卵母细胞成熟产生有害影响的能力对于长距离运输有很大帮助，但是更多的研究需要集中在通过超声波引导卵子采集（OPU），如牛或其他家畜物种来收集活体动物的卵母细胞。

骆驼的人工授精需要诱导排卵，因为骆驼是诱导排卵的。由于排卵发生在GnRH注射后的28～36 h，人工授精的最佳时间被认为是用GnRH处理后24 h，然而研究表明，在GnRH注射的同时也进行了人工授精怀孕结果为55%。初步研究表明，受孕需要多达300×106个活精子，但是最近的研究表明，子宫体内150×106活精子或仅80×106位于含有优势卵泡的卵巢的子宫角尖端，两者的妊娠率均为40%～50%[34]。稀释的精液可以在4℃下储存24 h，如果24 h后的运动性至少可以达到为35%～40%，则可以进行人工授精。 然而，使用新鲜精液可获得55%的怀孕率，但使用冷却的精液可将怀孕率降低至约25%[35]。

使用前列腺素合成酶抑制剂甲氯芬那酸也可以延长骆驼的黄体寿命。如果从排卵后第7 d开始口服甲氯芬那酸，直至胚胎移植后7 d，并在排卵后第8 d、10 d或12 d转移胚胎，妊娠率分别达到80%，60%和70%的妊娠率，而未用甲氯芬那酸处理的第8 d的对照组的妊娠率为10%[36]。

种间胚胎移植也是一种可用于保护濒危物种的方法。Niasari等人首次报道了旧世界骆驼科植物种间胚胎移植的第一份报告，首次单峰骆驼出生的双峰驼犊的成果。Niasari等人使用FSH递减剂量的方法处理一峰双峰驼超数排卵6 d，然后在第7 d单次注射FSH。每天进行卵巢超声检查直至大多数生长的卵泡达到13～17 mm的大小并成熟，并相隔24 h，与具有生育能力的雄性双峰驼交配两次。 在第一次交配时，给予雌性骆驼20 μg乙基酰胺。在供体骆驼交配后一天，单峰骆驼受体静脉注射25 mg猪促黄体生成素（LH）诱导排卵。在第一次交配后第8.5 d回收胚胎，并在LH注射后第7.5 d胚胎移植到受体中。胚胎移植后25 d诊断为妊娠。在分娩时出生的健康的双峰骆驼并没有任何特殊的并发症（例如难产和新生儿疾病）[37]。

6 结 语

目前，有关骆驼卵泡发育以及排卵的相关报道不多，需要更多的研究来了解雌性骆驼的卵巢、卵泡发生以及排卵的动力学有利于提高骆驼繁殖率。在骆驼的产犊间隔很长、繁殖季节比较短、性成熟晚等情况下，提高骆驼繁殖效率仍然是一项具有挑战性的任务。 迫切需要通过使用激素处理和卵巢超声波扫描来一致和准确地控制卵泡波生长周期和闭锁。 还应尝试促进青春期的开始，缩短产后间隔至受孕并在繁殖季节之外诱导排卵。种间胚胎移植提供了一种至关重要的方法，可以保护濒临灭绝的骆驼科动物免受灭绝的威胁，也可以在不引入活体动物的情况下将新种骆驼科植物引入其他国家。