四川部分地区禽源空肠弯曲菌MLST分型及遗传进化分析

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空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni)是广泛存在于家禽、家畜等动物体内的一种常见的人畜共患的食源性感染致病菌，主要引起人的急性胃肠炎，进入血液会引发败血症、脑炎、心内膜炎、心肌炎、反应性关节炎和泌尿系统感染等，严重的还会引发神经系统损伤性疾病格林巴利综合征(Guillain-Barre syndrome, GBS)[1-2]。禽类是空肠弯曲菌最主要的传染源，消费禽肉及制品与该菌的流行紧密相关，故而该菌早已成为全球公共卫生关注的重点[3]，因此对于空肠弯曲菌的分类研究，以探究其致病相关性显得尤为重要。

多位点序列分型(Multilocus sequence typing，MLST)技术是一种基于核酸序列测定的新型细菌分型方法，其与多位点酶电泳分析(Multilocus enzyme electrophoresis，MEE)原理相同，不同的是MLST通过测定细菌7个管家基因的核苷酸序列后根据序列的不同，经比对后分别命名不同序列号管家基因的等位基因值，7个管家基因不同序列号的组合决定菌株特异的序列型(Sequence type, ST)[4-5]。MLST数据库针对每个菌株个体都有相应的、唯一的ST型别且每个菌属的管家基因及引物均被标准化与统一，以便全球菌株MLST结果的比较分析。

依此，本研究以四川部分地区分离到的48株禽源空肠弯曲菌作为研究载体，使用MLST分子分型技术对其进行分子分型研究及遗传进化分析，以期进一步从分子水平研究该菌的遗传特性及分布特点。

1 材料与方法

1.1材料 48株分离株源于对四川多地区采集的禽类盲肠及内容物样品的分离[6]，哥伦比亚培养基、Skirrow培养基及其对应抗生素添加剂、脑心浸液均购自于成都康迪生物科技有限公司，细菌基因组提取试剂盒、胶回收试剂盒均购自于天根生化科技(北京)有限公司，其他试剂均为国产分析纯产品。

1.2分离株MLST分型方法、反应体系及参数 参照MLST数据库(http://www.mlst.net/ databases/)推荐的方法选取空肠弯曲菌 MLST分型相关的7个管家基因(aspA,glnA,glyA,gltA,tkt,pgm和uncA)作为目的基因，分别进行扩增与测序。

反应体系及参数：反应体系为25 μL：其中2×TaqPCR Mix 12.5 μL，引物(10 μmol/L)各1 μL，模板2 μL，ddH2O补足至25 μL；反应参数为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、50 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min，35个循环，72 ℃ 10 min。反应结束后，将产物经琼脂糖凝胶电泳后，使用试剂盒回收条带单一且明亮的扩增片段送至华大基因测序。

1.3序列类型(Sequence type，ST)的确定 对7个管家基因的双向测序图谱进行比对，确保序列一致后将不同的基因序列在MLST数据库中提交，进行检索比对。根据数据库提供的每种等位基因的序列号，确定7个管家基因的组合，即为该菌株的ST型，并根据该菌株的ST型在数据库中的排列序号对其命名。经命名的ST型或出现新ST型，其归因于两种情况，存在新的等位基因序列或存在各等位基因位点的新组合[7]。相似的ST型菌株可组成一个ST序列群，即一个克隆系(Clonal complex，CC)[8]。

1.4遗传进化分析 确定所有分离株的ST型别及克隆系后，从MLST数据库网站(http://www.mlst.net/databases/)下载分离株及近5年国内外多个国家不同源分离株的7个等位基因的串联序列(按照aspA-glnA-gltA-glyA-pgm-tkt-uncA的顺序排列)，采用MEGA6.0软件中的Neighbor-jioning方法构建系统进化树，分析本次分离株和其他地区分离株之间的遗传进化关系。

2 结 果

2.1分离株管家基因扩增结果 使用空肠弯曲菌7个管家基因扩增引物对分离株的管家基因进行扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳后，结果显示(图1，其中1株分离株)各管家基因的片段大小与预期结果一致。

Note: M: DNA Marker; 1：glyA；2：glnA；3：gltA；4：tkt；5：uncA；6：aspA；7：pgm图1 空肠弯曲菌的MLST扩增结果Fig.1 MLST amplification results of Campylobacter jejuni

2.2 MLST分型结果与分析

2.2.1新序列型及新等位基因值 48株分离株中共含24种不同的序列型，其中22株分离株含有新序列型属11个新序列型，占分离株的45.83%。新序列型中眉山鹌鹑源的8株分离株和雅安鸡源的3

株分离株全为新序列型；温江鸡源的分离株中有7株属于新序列型，占温江鸡源分离株的26.92%；温江鸭源的分离株中有1株属于新序列型；金堂鸡源的分离株有3株属于新序列型，占金堂分离株的33.33%。

48株分离株中共有14株分离株含有新等位基因序列，7个管家基因中的aspA,pgm,tkt,uncA基因存在新的等位基因序列，而其余3个等位基因均未发现新的等位基因序列。14株分离株各存在1个新等位基因序列，其中tkt位点共有10株分离株(V5、V6、V13-20)发现新等位基因序列，分离株V26、V27的pgm位点为新等位基因序列，aspA和uncA位点各有1株分离株为新等位基因序列；分离株中的V26、V27所属的序列型有对应的克隆系均为ST-1332CC。除此之外，另有8株分离株(C2、C4、V7、V8、V25、V33、V34、V47)存在等位基因位点的新组合，属于新序列型且均无对应的克隆系，为独特型(表1)。

表1 空肠弯曲菌分离株中的新等位基因及新序列型
Tab.1 New allele sequences and new series of alleles ofCampylobacterjejuniisolates

StrainsaspAglnAgltAglyApgmtktuncASTClonal complexID numberV5862029228485668358670*-ID=56181V6862029228485668358670*-ID=56181V1371141221367668675*-ID=57597V1471141221367668675*-ID=57597V1571141221367668675*-ID=57597V1671141221367668675*-ID=57597V1771141221367668675*-ID=57597V1871141221367668675*-ID=57597V1971141221367668675*-ID=57597V2071141221367668675*-ID=57597V262142882225588671*ST-1332CCID=50116V272142882225588671*ST-1332CCID=50116V2886180470127255438673*-ID=50118V3744422210318676*-ID=56169C2861447047029358668*-ID=56179C486202922612729238669*-ID=56180V786202922812729238672*-ID=56183V886202922612729238669*-ID=56180V252348292264852518674*-ID=50120V333747629228682255428409*-ID=56166V347174646943358410*-ID=56167V477174646943358410*-ID=56167

Note: The bolded portion are the new allele value；* New sequence type；- No corresponding clones; ID Website：https://pubmlst.org/bigsdb?db=pubmlst_campylobacter_isolates&page=query

2.2.248株分离株所属不同序列型和克隆系的数量 经序列比对后，48株分离株共含有24种不同的序列型，分属于9种克隆系和11种独特型。其中11种独特型共包含21株分离株，占总分离株的43.75%。CC-21、CC-353和CC-1332均包含2种以上序列型，分别占菌株总数的12.5%、8.33%、6.25%，其余克隆系只包含一种序列型。所有的不同序列型中，独特型ST-8675包含的菌株数最多，共包含8株分离株，占总菌株数的16.67%，ST-760、ST-464、ST-161和ST-354均包含3株以上的分离株，其余序列型只包含1-2株分离株，具体信息(表2)。

表2 48株分离株所属不同序列型和克隆系的数量
Tab.2 Different STs and clonal complex contain 48 isolates

Clonal complexSTNumberClonal complexSTNumberCC-212982CC-692433427604Unassigned22741CC-45137184091CC-48429184102CC-52161386681CC-353586418669274521867028090286721CC-354354386731CC-464464486741CC-13326961867588671286761

2.348分离株MLST结果统计与分析 将分离株等位基因扩增结果统计后发现48株分离株中，等位基因值的数量最多的是pgm，为14个；其次glnA，为12个；gltA、tkt、uncA、aspA均为9个；最少的glyA，为8个。等位基因值数量的多少在某种程度上反应了该位点基因的多样性，依此或可推知pgm基因最不稳定，突变最多，而glyA基因较稳定。依据本研究中出现的所有等位基因数值及其各数值所对应菌株的数量，结果显示，glyA基因值为2的细菌数量最多，为21株；uncA基因值为6的细菌数量次之，为17株；而出现的各管家基因值为1的菌株分布最为广泛。

2.4不同克隆系、序列型包含的不同地区来源菌株的数量 将不同克隆系、序列型包含的不同地区来源的菌株的数量进行统计后，结果显示，源于(金堂养鸡场)的9株分离株率属于6种序列型；源于(温江活禽市场2、3)地区的分离株均有8株率属于6种序列型；源于(眉山鹌鹑养殖场)的8株分离株均归属于ST-8675序列型，而源于(温江养鸡场2)的分离株仅有2株率属于2种序列型。针对克隆系而言，以CC-21包含的分离株最多为6株，以CC-45包含的分离株最少为1株。除此之外可发现同一个序列型包含2株及以上菌株的，菌株多为同一地区分离株，如ST-298包含2株(温江活禽市场1)的分离株，ST-760包含3株(温江养鸡场1)的分离株，表明菌株的流行与地域特征有关。

2.5分离株的遗传进化分析 使用MEGA6.0软件对48株分离株所含的24种序列型及国内2株腹泻病人空肠弯曲菌分离株、2株鸡源分离株、1株鸭源分离株，以及英国、丹麦、波兰、新西兰、阿根廷、韩国、泰国、肯尼亚、印度鸡源分离株各1株，共38株空肠弯曲菌的序列型进行遗传进化树的构建(图2)。结果显示，泰国和丹麦的ST-8659和ST-8661型别分离株与其余36个型别分离株处于不同分支，遗传距离较远；眉山鹌鹑源的ST-8675型的8株分离株(V13-20)与其同属于一大分支的其余35个型别分离株遗传距离较远；属于同一克隆系的2种型别菌株遗传距离近，如同属于CC-21克隆系的ST-298与ST-760处于同一小分支、属于CC-1332克隆系的ST-8671与ST-696处于同一小分支；来源于同一地区不同场的分离株遗传距离较近，如来源于(温江活禽市场1)ST-5864序列型的V26分离株和(温江养鸡场2、活禽市场3)ST-8090序列型的V40、V43分离株处于同一小分支，亲缘关系较近。除此之外，本研究中序列型为ST-354的V24、V42、V46分离株与英国ST-354序列型分离株处于同一小分支并与印度ST-8657序列型菌株处于同一分支，暗示着不同克隆系间的序列也存在密切相关性；国内腹泻病人ST-8727序列型分离株与本研究中鸡源分离株C1亲缘关系最近，或可推之鸡与人类感染有重要关系。

图2 本研究24种序列型和国内外14株分离株序列型的遗传进化树Fig.2 Phylogenetic tree of 24 kinds of sequence types in this study and 14 sequence types in home and abroad

3 讨 论

MLST作为一种常用且准确的分子分型方法，具有分辨率高、可积累、重复性强等优势得到了研究者的广泛关注[9-10]。本研究对四川部分地区分离的48株禽源空肠弯曲菌进行MLST分型，共获得24种不同的序列型，其中有22株分离株属于11种新序列型，新序列型占比为45.83%，发现的新序列型数量所占比率与薛峰[11]、董俊[12]等从禽类肠道分离的菌株、王新等[13]从禽肉分离的菌株以及Petra等[14]自肉鸡群分离的菌株新序列型所占比率均有差异，或与不同地区分离株的遗传进化有关。在发现的新序列型中，眉山鹌鹑源的8株分离株均为新序列型且变异度较小，或与菌株间的基因水平转移、代谢类型相似等因素有关，是否如此机制还有待于进一步的研究证实后以便为更好地揭示空肠弯曲菌致病性与分子分型之间的相关性。

空肠弯曲菌可以在多种不同宿主间进行传播，但某一类宿主所携带的空肠弯曲菌则大多归为某一序列型或克隆系，这可能与生态适应、地理隔离、宿主相关等因素均有关[15]。本研究中的不同源分离株均存在独特型序列，不同源分离株中的独特型序列可反映出该源分离株基因间的多样性。对分离株所含的序列型进行遗传进化分析发现，鹌鹑源分离株V13-20与鸭源、鸡源分离株的亲缘关系较远，表明不同家禽中的空肠弯曲菌序列型存在差异具有多样性，分离株中出现新序列型或与空肠弯曲菌MLST数据库中的数据量缺乏有关；分离株所含的CC-21、CC-45、CC-353、CC-354克隆系与Ragimbeau等[16]自腹泻病人中分离到的空肠弯曲菌所含的克隆系有交叉重叠，暗示着禽类对于人类致病有潜在相关性。综上所述，本研究结果为MLST数据库的扩充及基于该方法探究不同地域、宿主来源的空肠弯曲菌致病性与分子分型的相关性提供了参考依据。

利益冲突：无