环介导等温扩增技术在致病微生物检测中的应用

徐美迪，木兰，牛超

1.内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特010110；

2.军事科学院 军事医学研究院 环境医学与作业医学研究所，天津300050

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术由Notomi等[1]于2000年创建，是一种在等温条件下即可对靶序列进行快速、特异、灵敏检测的核酸扩增技术。基于以上诸多优势，LAMP技术现已广泛用于核酸检测相关领域，如病原体识别、性别鉴定及食品检测等。

1 LAMP技术概况

环介导等温扩增技术的基本原理是，当目的DNA解链后,针对靶基因设计的4条特异性内外引物分别识别到相应互补位点，再利用BstDNA聚合酶在65℃等温条件下对其进行延伸，先形成一个两尾端各自互补的哑铃样DNA结构，随后，在此基础上不断地被引物识别、延伸和扩增，最终生成由一系列反向重复的目的基因构成的茎环样结构和多环花椰菜样结构组成的DNA片段混合物[2]，整个体系于1 h内即可实现对目的片段的高效特异扩增。此外，Nagamine等[3]在LAMP体系中添加了2条环引物，使得LAMP反应时间缩短近一半，大大提高了扩增效率。环引物也是通过与茎环结构结合启动链置换DNA合成，所有茎环DNA或与内引物杂交，或与环状引物杂交，从而提高了检测效率。LAMP结果可通过2%琼脂糖凝胶电泳、添加染料、观察浊度等方法进行判读。首先，在扩增结束后，可将产物于2%琼脂糖凝胶中电泳，通过观察阶梯状条带的有无来判断结果。但由于电泳时致癌物质溴化乙锭的加入及开盖加样后气溶胶的污染，使得此方法并不是检测LAMP结果的首选方法。作为电泳的替代品，钙黄绿素、SYBR greenⅠ和HNB染料等不仅远离了致癌物，还实现了对DNA产物的直接检测。钙黄绿素是一种在反应前添加的染料，含有金属离子结合荧光团，可使阳性反应体系在紫外光（365 nm）[4]下发出荧光，在自然光下发生颜色变化（橙色到绿色），从而大大提高了对结果判断的准确性。SYBR greenⅠ的加入会使阳性反应体系出现红橙色至黄绿色的颜色变化，且在紫外光下发出荧光。尽管其具有良好的灵敏度，但在扩增前加入，可抑制LAMP反应进行；在扩增结束后加入，开盖又易造成假阳性结果[5]，因此并不利于其广泛使用。由原理可知，随着LAMP反应的不断进行，副产物焦磷酸镁白色沉淀会逐渐增加，基于此特点，LAMP可通过肉眼观察白色沉淀的方法对结果进行直接判读；若使用实时浊度计进行反应，如Loopamp（Eiken Chemical公司）的LA-200、LA-320及LA-500等，还可实现对结果的实时监测。

LAMP作为一种新型核酸检测技术，有几点优势尤为突出。首先，与传统PCR技术相比，LAMP体系中的4条引物须分别与靶基因的6个或8个特异区完全匹配后才能反应；而PCR体系仅需上下游各1条引物与靶基因匹配即可，这意味着LAMP具有更高的特异性[2]。此外，LAMP检测效率较高。在LAMP反应起始阶段无须DNA模板的热变性过程，从而缩短了反应起始时间；由于LAMP扩增模板呈哑铃状结构，含多个扩增起始点，可同时进行扩增，因此提高了扩增效率。PCR需要至少90 min才能完成的扩增反应，LAMP仅需30 min，大大节约了检测时间。LAMP最突出的优势在于检测方便，结果易判读。由于LAMP是一种等温扩增技术，仅需一个能保持恒定温度的水浴锅或加热块即可进行反应，因此降低了对仪器的要求。检测结果可简单地通过肉眼观察有无白色沉淀进行判断，无须再进行繁琐的电泳实验来验证，降低了终点检测对仪器的要求。另外，介于BstDNA聚合酶在缓冲溶液中的特性，Tanner等[6]开发了一种用于LAMP的新型pH敏感染料。随着LAMP反应进行，会出现显著的pH值变化，pH指示剂染料的加入即可轻松地监测到LAMP反应是否进行，这一研究有助于LAMP作为便捷检测工具在发展中国家的应用。此外，有研究表明，LAMP检测并不受样品中非靶标DNA[7]、PCR抑制剂（如血液）及未处理样品[8]的影响，体现出LAMP具有极高的稳定性。

2 在致病性微生物检测中的应用

2.1 检测致病性细菌

近年来，LAMP技术已广泛应用于快速检测致病性细菌，方法较为成熟，如空肠弯曲杆菌[9]、伤寒沙门菌[10]、脑膜炎奈瑟菌[11]和李斯特菌[12]等。Bakhtiari[13]通过靶向幽门螺杆菌ureC基因设计特异性引物建立了LAMP体系，检测限与PCR测定的相同，为10 fg DNA（6个拷贝数）。一般情况下，实际样品中的微生物种类和数量是未知的，因此，有必要对多种未知微生物进行同时检测。由原理可知，LAMP扩增产物是长度不等的DNA混合片段，常规检测只能判断有无扩增反应发生而无法特异辨别扩增产物的来源。为了实现对多种致病微生物的特异检测，现已开发出一系列以LAMP为基础的多重LAMP（multiplex LAMP，mLAMP）[14]技术，以满足快速检测多种未知致病微生物的需求。Lee等[15]通过LAMP-PCR、杂交、限制性内切核酸酶消化及ELISA比色法，在单管内同时检测了对异烟肼、乙胺丁醇和链霉素有抗性的多种结核分枝杆菌。Liu等[16]建立了用于检测沙门菌和副溶血性弧菌的多重LAMP，通过调整沙门菌引物组的浓度解决了LAMP选择性扩增问题，同时利用2种产物之间扩增曲线及熔解温度的不同实现了对这2种病原体的特异检测。Duarte[17]将mLAMP与芯片结合，实现了对hlyA（单增李斯特菌）、stx2（大肠杆菌O157）和in⁃vA（沙门菌）等3种靶基因的同时检测，最低检测限为105CFU/mL。尽管检测的灵敏度不高，但实现了对多种菌株的同时检测。此外，检测过程中进样、控温及结果鉴定完全由仪器完成，更适合于大规模的样品检测。

2.2 检测致病性病毒

逆转录环介导等温扩增（reverse transcrip⁃tion LAMP，RT-LAMP）技术是通过在LAMP体系中加入逆转录酶来实现一步法检测RNA病毒的核酸扩增技术[18]。与RT-PCR相同，RT-LAMP也是先利用逆转录酶合成与RNA互补的DNA，随后在DNA聚合酶的作用下，对刚刚合成的DNA进行不断的扩增，最终达到高效率扩增RNA病毒的目的。目前，针对丙型肝炎病毒[19]、登革热病毒[20]、埃博拉病毒[21]、寨卡病毒[22]和中东呼吸综合征冠状病毒[23]等都已建立了RT-LAMP体系，其中，用于诊断埃博拉病毒[24]的LAMP试剂盒已被制成便携式设备，广泛用于现场检测。目前，RT-LAMP最成功的用途之一是检测人免疫缺陷病毒（HIV）。Ocwieja等[25]建立了用于诊断HIV蛰伏阶段的RT-LAMP技术；Damhorst等[26]将数字设备与RT-LAMP相结合，通过智能手机即可观察到全血中HIV-1的感染情况，检测限为每微升全血670个病毒，该数字化RT-LAMP技术可辅助初级保健机构对HIV感染人群的筛查及基层实验室对HIV检测结果的判读。此外，RT-LAMP也可用于检测动植物病毒。Batai病毒（BATV）是一种由蚊子传播，且可导致反刍动物先天性缺陷的病毒。Liu等[27]针对BATV的M基因建立了RT-LAMP体系并对其进行优化。研究表明，RT-LAMP仅需40 min完成的Batai病毒检测，RT-PCR需数小时才能完成；且RT-LAMP灵敏度低至每微升2.86个拷 贝，比qRT-PCR高 约100倍。Peng等[28]通 过靶向苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）的衣壳蛋白基因建立了RT-LAMP检测体系。与RT-PCR（2.29 μg/μL）相比，该体系在64℃下可检测低至0.02 μg/μL的病毒，灵敏度提高了100倍。该体系的建立实现了对苹果褪绿叶斑病毒的现场检测，控制了ACLSV的传播。同时，多重LAMP体系也可应用于病毒检测。Lau等[29]建立了用于检测登革热病毒的单管RT-mLAMP体系。研究中，针对登革热病毒的每种血清型设计了各自的LAMP引物组，分别靶向DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4的3'端非编码区，并将所有引物添加到含有羟基萘酚蓝（HNB）的单管LAMP体系中反应60 min，最终通过肉眼观察颜色变化来确定检测样品中是否存在登革热病毒。实验中未观察到与其他相关虫媒病毒之间存在交叉反应，且此方法的灵敏度较高。

2.3 检测致病性寄生虫

原生动物寄生虫同样对人类有害。Nzelu[30]建立了检测利什曼原虫的LAMP体系，并利用122份临床可疑样品对其进行测试，结果显示LAMP体系能够有效检测到101个DNA拷贝。Poole等[31]针对RF4基因建立了检测罗阿丝虫的高灵敏LAMP体系，且在30 min内即可完成对微丝蚴的检测，解决了野外快速检测难和寄生虫感染早期管理难等诸多难题。此外，有研究将mLAMP与斑点酶联免疫吸附法相结合，实现了对猪带绦虫、牛带绦虫和亚洲牛带绦虫的区分。实验中，根据细胞色素c氧化酶亚基1基因设计特异性引物，并对引物进行了标记（洋地黄毒苷、异硫氰酸荧光素和四甲基罗丹明标记FIP引物、生物素标记BIP引物），最终通过观察膜上的紫色点有无来判断检测结果，从而实现对这些物种的差异性检测[32]。Mwendwa等[33]建立了检测溶组织内阿米巴的LAMP体系，体系中加入可加快反应速度的环状引物，使得反应时间缩短了约11 min。为了评估其灵敏度，实验中将此方法与标准的LAMP和PCR方法相比较，同时对临床样品中溶组织内阿米巴的DNA进行检测，灵敏度分别是10-7（～30 pg/mL）、10-5（～3 ng/mL）和10-4（～30 ng/mL），可以看出，加入环状引物的LAMP体系不仅加快了反应速率，还提高了整个体系的灵敏度。

2.4 检测致病性真菌

真菌的常规检测方法费力且昂贵。目前，一项用于检测白色念珠菌、新型隐球菌和毛霉菌等真菌的mLAMP技术已由Nakayama等[34]建立。Karakkat等[35]针对冷季型草坪草的3种常见真菌根病原体建立了LAMP体系。此外，Luo等[36]分别针对黄曲霉、集蜂曲霉和凯氏曲霉的靶基因设计了各自的特异性引物，建立了定量检测3种真菌的实时LAMP体系。

综上所述，LAMP技术的应用明显提高了检测致病性微生物的灵敏度，缩短了检测时间，简化了操作步骤，为致病性微生物的检测带来了极大便利，体现了LAMP技术在生物安全检测领域极大的应用价值。

3 新型LAMP

为了进一步满足现场检测和基层医疗单位对检测技术的要求，在目前LAMP、mLAMP及与其他检测技术相结合的基础上，一些新型LAMP被逐渐开发出来。

3.1 电子LAMP

Salinas等[37]开发了电子LAMP技术，可通过Tk图形界面对LAMP引物与靶序列的匹配度进行快速测试，有助于快速确定现有引物检测变异体序列的效率和概率。

3.2 应用OmniAmp聚合酶的LAMP

OmniAmp聚合酶有着与Bst3.0聚合酶相似的活性，可对DNA和RNA进行直接检测。Chander等[38]利用OmniAmp聚合酶，针对6种RNA病毒建立了新型RT-LAMP检测方法。结果显示，与传统的Bst聚合酶相比，OmniAmp聚合酶热稳定性更高，受全血成分的抑制作用更小，用于低病毒血症样品检测的速度更快，在环境温度下可储存的时间更长，且有着可增加逆转录酶活性的强大性能。基于这些优势，OmniAmp聚合酶更适合用于侧流装置、冻干LAMP及现场装置的开发[39]。

3.3 免疫横向流动检测

免疫横向流动检测（lateral flow assay，LFA）是LAMP的一种常用配套手段，由于其具有成本低、人性化、简单、快速、便携等优势，目前备受欢迎。Huang等[40]通过结合由异硫氰酸酯标记的DNA探针中的荧光素和生物素化的LAMP扩增子建立了横向流速测定，在测试线上即可观察到检测结果。Yin等[41]利用多重LFA-LAMP实现了对金黄色葡萄球菌sea和seb基因的同时检测。此外，免疫横向流动检测已可用于检测麻疹病毒[42]、巴贝虫病[43]、恶性疟原虫和间日疟原虫[44]等。

3.4 冻干LAMP和LAMP试剂盒

基于现场检测的需求，现已开发出多种形式的LAMP，如冻干状态LAMP试剂和用于特异性检测微生物的试剂盒。冻干LAMP试剂呈干燥粉末状，可在环境温度下长期储存，更适于现场检测。Hayashida[45]利用单管冻干LAMP检测到了非洲锥虫病。研究显示，靶向重复插入移动元件（RIME）、18S rRNA和SRA-LAMP的检测限分别为0.01、0.1和1个寄生虫当量DNA，且与普通的LAMP试剂热稳定性相同。Chen等使用冻干LAMP及靶向lipL32和lipL41基因的引物组检测到了钩端螺旋体。该研究分别使用不同温度（4℃、25℃和37℃）储存的冻干LAMP和普通LAMP试剂对钩端螺旋体进行检测，并对检测方法的稳定性和灵敏度进行了评估。结果显示，各方法的检测限均为12拷贝基因组DNA，且稳定性相近[46]。Carter等利用RT-LAMP冻干法检测到了扎伊尔埃博拉病毒（ZEBOV），强调了通过关键修饰反应组分来保持冻干试剂稳定的重要性[47]。LAMP试剂盒（如Loopamp TB检测试剂盒、布氏锥虫检测试剂盒、单核细胞增生李斯特菌检测试剂盒、军团菌筛选试剂盒E、疟疾检测试剂盒、SARS冠状病毒检测试剂盒、弯曲杆菌检测试剂盒、肺炎支原体检测试剂盒、大肠杆菌O157检测试剂盒、隐孢子虫检测试剂盒等）和LAMP引物组（如针对西尼罗病毒、禽流感H5和H7病毒、FluA流感病毒等的引物）均可从Eiken Chemical公司购买。

4 结语

作为一种新兴的核酸扩增技术，LAMP现已广泛应用于微生物检测。与传统的检测方法相比，LAMP具有高灵敏度、高特异性、低成本、简单操作等诸多优势。目前，应用LAMP的中国食品检测标准已生成，如进出口食品中致病菌环介导等温扩增检测方法及出口食品中转基因成分环介导等温扩增检测方法等。尽管LAMP技术已被广泛使用，但也存在一些不足。在引物设计方面，虽然可以应用免费的在线软件进行设计，但由于其是针对较短靶序列中的6～8个区域设计4～6条引物，在某些情况下，一些扩增效率较高的靶位点可能会被忽略，因此，应手动进行引物设计[48]，而且LAMP的超长DNA终产物并不适用于克隆或其他分子生物学的研究[4]。在mLAMP体系中，同时使用多组引物会增加引物间杂交的几率，导致非特异性扩增[49]。出现上述现象，建议重新设计引物。LAMP体系扩增效率极高，并且产物极其稳定，不易降解，因此易发生携带污染，出现假阳性的结果[50]。若出现上述情况，建议换用专用的移液管和过滤好的枪头在超净台中进行实验。此外，LAMP体系对微量污染物非常灵敏，一些开管操作，如进行琼脂糖凝胶电泳，应在单独房间内操作，以避免气溶胶污染。当仅用比浊和比色法确定LAMP反应结果时，由于个体对颜色的主观感知不同，结果可能会出现偏差[51]。和PCR不同，LAMP扩增产物电泳后呈阶梯形条带或拖尾现象，难以通过条带大小来识别LAMP检测目标物[52]。

为了更好地应用到基层实验室和野外检测，LAMP技术还须进一步完善与优化，比如将mLAMP技术与芯片、数字核酸技术相联合等。基于LAMP技术良好的应用前景，希望在不久的将来，LAMP技术可与其他新的检测技术相结合，逐渐替代传统微生物检测技术，为生物安全提供更多保障。