长链非编码RNA-重编码调控因子与肿瘤的研究进展

周晋宇，柳杰，尹冶，辉红蕾，王玉明

昆明医科大学 第二附属医院 检验科，云南 昆明650000

癌症是世界范围内一个主要的公共卫生问题，也是美国第二大死亡原因。据美国癌症协会2018年统计数据，美国将新增1 735 350例癌症病例，609 640例将死于癌症，亦即几乎每天1700人死亡。最常见的癌症死亡原因包括男性肺癌、前列腺癌和结直肠癌，女性肺癌、乳腺癌和结直肠癌。这4种癌症占所有癌症死亡的45%[1]。除此之外，各类肿瘤的发病率及死亡率出现逐年上升的趋势，使对肿瘤发病原因和靶向治疗的研究迫在眉睫。Hanahan和Weinberg[2]总结了人类肿瘤多级发展过程中形成的10个生物功能，构成了癌症的特征，这些特征为分析复杂的肿瘤性疾病提供了一个组织原则。这10个特征包括：持续的增殖信号；避开生长抑制；逃避免疫破坏；无限增殖；促肿瘤炎症；激活浸润和转移；诱导血管生成；基因组的不稳定和突变；抵抗细胞死亡；重构能量代谢体系。研究癌症发现机理30年来取得了显著进步，其硕果之一就是通过人类基因组测序可以部分揭示致癌基因在疾病发生发展中所起的作用。人类基因组测序结果显示，具有编码蛋白质功能的基因不到全部基因组序列的2%，而在占据人类基因组98%以上的非蛋白编码序列中，绝大多数为长链非编码RNA（long non-cod⁃ing RNA，LncRNA）。随着大量LncRNA的发现，人们的研究重点从编码RNA转移到LncRNA，并探讨其在生物体内的作用机制。2010年发现了基因间长链非编码RNA（large intergenic non-cod⁃ing RNA，LincRNA）-重编码调控因子（regulator of reprogramming，ROR），它不仅能够调控重编程过程，而且在癌症发生、发展过程中也扮演重要角色。但是，目前已知功能的LncRNA并不多，对LincRNA-ROR的功能研究更少。为了更全面地揭示其在肿瘤发病过程中的作用，我们在此将对LincRNA-ROR的发现及其在癌症及癌症调控网络中的重要作用做简要综述。

1 LincRNA-ROR简介

LncRNA是一组广泛存在于哺乳动物细胞中的转录长度超过200 nt的非编码序列，通常由RNA聚合酶Ⅱ转录形成，因其缺少有效开放读框而很少编码或不能编码蛋白质[3]。研究表明，它们可以通过与微小RNA（microRNA，miRNA）中的mRNA应答元件结合，竞争性地海绵化miRNA，最终调控基因表达，从而发挥竞争性内源RNA（competing endogenous RNAs，ceRNAs）的竞争作用[4]。有研究表明，LncRNA参与的生物学过程包括染色质重构、转录及转录后调节下游基因的表达、细胞间信号传递。更值得注意的是，LncRNA在细胞异常调节、诱导肿瘤发生中起关键作用[5]。

LincRNA-ROR是基因间LncRNA的一种，由4个外显子组成，位于染色体18q21.31，长2.6 kb。Loewer等[6]最初发现其在胚胎干细胞中参与细胞重编程过程，能够调节分化细胞转换为诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）的重编过程，因此得名。近期研究表明，LincRNAROR是一种重新编程的调节剂，与肿瘤发生有关，在未分化的肿瘤中过表达，与肿瘤复发和不良的治疗反应有很强的相关性。在结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌等组织及细胞中异常表达，且已证明与肿瘤细胞的增殖、侵袭及迁移等过程相关[7]。

据Loewer等[6]报道，LincRNA-ROR是多能干细胞重编程衍生的启动子，是核心转录因子（tran⁃scription factors，TFs）Oct4、Sox2和Nanog的结合位点，被认为是调控这些TFs表达的一种ceRNA。LincRNA-ROR通过在转录后水平吸附miR-145，对人类胚胎干细胞（human embryonic stem cells，hESCs）的自我更新和分化有巨大影响。此外有研究表明，LincRNA-ROR的表达水平限制在低分化细胞群中，与干细胞或具有干细胞样功能的细胞相比，所有体细胞的LincRNA-ROR表达都较低，提示LincRNA-ROR的表达可能与干细胞样特性有关[8]。

2 LincRNA-ROR的作用机制

LincRNA-ROR是一种典型的LncRNA，它在与miRNA的相互作用和维持干细胞多能性方面起着重要的调控作用，同时也可触发上皮-间充质转化（epi-to-mesenchymal transition，EMT）。LincRNA-ROR在缺氧条件下也发挥了各种关键作用，且对肿瘤的发生有着促进作用。Takahashi等[9]研究发现，LincRNA-ROR能够在低氧环境中通过调节低氧诱导因子1α（hypoxia inducible fac⁃tor-1α，HIF-1α）及其下游基因来调控肝癌细胞的生长增殖。除此之外，虽然LincRNA-ROR主要促进肿瘤发生，但它部分通过阻断KLF4的表达，也可以抑制肿瘤细胞增殖和胶质瘤干细胞（glio⁃ma stem cells，GSCs）自我更新[10]。

2.1 LincRNA-ROR作为ceRNA调节细胞进程

ceRNA通过与miRNA应答元件（miRNA re⁃spond elements，MREs）相互作用，在转录组的调控网络中扮演重要角色。有研究表明，LncRNA在调控miRNA的浓度和生物学功能方面可能作为ceRNA发挥作用[11]，LincRNA-ROR也如此，其过表达可能逆转miRNA与其靶基因之间的负调控。Wang等[7]在LincRNA-ROR与相关miRNA之间建立了一个调控反馈循环的模型，他们发现LincRNA-ROR作为ceRNA来调控包括Oct4、Sox2和Nanog在内的TFs的表达，以及通过分子海绵吸附hESCs中差异相关的miRNA来调控同源域蛋白，特别是miR-145。这些TFs已被证实在各种肿瘤中表达，并与未分化表型相关。通过外源性方式将TFs导入小鼠或成人细胞中，并将其重新编程为iPSCs，从而诱导多能性。此外，LincRNAROR不仅对多能细胞有影响，对癌症干细胞（can⁃cer stem cells，CSCs）也有影响，敲低LincRNAROR可以降低CSCs成为癌症起源的可能性，从而促进相关研究和细胞治疗。在以上研究基础上，Gao等[12]指出沉默LincRNA-ROR可以抑制胰腺癌干细胞（pancreatic cancer stem cells，PCSCs）的增殖、侵袭和致癌性，从而降低PCSCs的恶性特征。因此LincRNA-ROR可以作为胰腺癌的预后判断因子。此外，有研究已经证实，在三阴性乳腺癌中，LincRNA-ROR的功能与ceRNA类似，它会海绵化miR-145，从而上调ARF6的表达。ARF6通过E-钙黏蛋白调控乳腺肿瘤细胞的黏附和侵袭特性。值得注意的是，Duru等[13]认为来自CD49f+/CD44+/CD24-单细胞的侵袭性克隆激活Oct4/Sox2/LincRNA-ROR信号轴，从而维持癌症干细胞的自我更新，并调节乳腺癌的分化。另外，LincRNAROR被确认为预后判断生物标志物，并与miR-145相关，在结肠癌中发挥作用[14]。Zou等[15-16]研究表明，LincRNA-ROR可以作为分子海绵，竞争性地通过miR-145调控Sox2的表达，从而维持人类羊膜上皮细胞（HuAECs）多能性和提高它们分化成胰岛β细胞的效率，这已被移植到糖尿病患者或动物模型证明它们可以帮助恢复胰岛功能，因此有可能是潜在的治疗方法。此外，有证据表明，LincRNA-ROR通过类ceRNA功能抑制miR-133的表达和功能，从而促进了胎儿基因（ANP和BNP）和心肌细胞肥大相关基因的再表达[17]。Lin⁃cRNA-ROR通过抑制miRNAs，在发育和组织再生过程中调控遗传网络，并有可能成为许多疾病的新疗法。

2.2 LincRNA-ROR触发EMT进程

EMT是上皮细胞失去细胞极性和细胞黏附，获得迁移和侵袭特性，成为间充质干细胞的过程。LincRNA-ROR在上皮肿瘤发生中的作用涉及EMT触发和干细胞获得，抑制LincRNA-ROR可能逆转EMT过程[18]。LincRNA-ROR可以阻止miR-205靶基因的降解，从而诱导EMT，促进乳腺癌的进展和转移。此外，Chen等[19]发现，过表达的LincRNA-ROR能够降低乳腺癌细胞系对抗癌药物5-氟尿嘧啶（5-FU）和紫杉醇的敏感性。通过诱导与5-FU和紫杉醇耐药相关的EMT，证实了LincRNA-ROR是乳腺癌多重耐药的重要标志。此外，LincRNA-ROR能够通过上调E盒结合锌指蛋白（zinc finger E-box-binding protein 1，ZEB1）而诱导启动EMT程序，维持胰腺癌的干性，从而能够促进胰腺癌细胞的侵袭和转移[20]。

2.3 LincRNA-ROR诱骗基因特异性组蛋白甲基化促进肿瘤发生

组蛋白经过翻译后修饰，改变了其与DNA和核蛋白的相互作用，这些修饰包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、亚酰化、瓜氨酸化和ADP-核糖基化。组蛋白修饰影响基因调控、DNA修复、染色体浓缩和精子形成等生物过程。Fan等[21]首先报道了LincRNA-ROR作为诱骗oncoRNA阻止染色质调节因子（G9A甲基转移酶）的招募行为，进一步消除组蛋白H3K9修饰的启动子TESC，并诱导异常的肿瘤生长和转移。而在没有Lin⁃cRNA-ROR表达的情况下，G9A甲基转移酶恢复到TESC启动子，从而通过靶向组蛋白H3K9甲基化沉默TESC的表达，显著抑制肿瘤进展。此研究结果揭示了在肿瘤发生中LincRNA-ROR作为诱骗oncoRNA与组蛋白修饰的全新机制。

3 LincRNA-ROR与癌症

3.1 LincRNA-ROR与结直肠癌（colorectal can⁃cer，CRC）

CRC是最常见的恶性肿瘤之一，恶性程度高，预后差，在全球癌症相关死亡人数中排名第三，每年死亡人数约有69万[22]。Li等[23]研究发现，CRC组织中LincRNA-ROR表达水平比相邻组织明显升高，敲减LincRNA-ROR能显著降低HT29细胞增殖、触发细胞周期阻滞、增强细胞凋亡，而LincRNA-ROR过表达对M5细胞系有显著的相反作用。此外，研究发现LincRNA-ROR下调可抑制CRC细胞的生长和增殖。因此，认为LincRNAROR可能在CRC中作为一种促癌基因发挥作用。此外，在CRC中敲减LincRNA-ROR能显著增加p53及其靶基因的蛋白表达水平，而Linc-ROR过表达则相反。p53蛋白水平与体内LincRNA-ROR呈负相关。这些数据表明，在CRC发生和发展中，LincRNA-ROR的机制可能部分通过p53的信号通路起作用。综上所述，LincRNA-ROR有可能成为CRC的一种创新性和前瞻性的治疗靶点。

3.2 LincRNA-ROR与胰腺癌

胰腺癌是恶性率最高的肿瘤之一，死亡率极高。Gao等[12]发现胰腺癌组织中的LincRNA-ROR明显上调，且与肿瘤大小有关。此外，LincRNAROR表达水平较低的患者的总生存时间明显长于中等或较强LincRNA-ROR表达的患者。通过RNA干扰敲减LincRNA-ROR可抑制PCSCs的增殖，诱导细胞凋亡，减少迁移。裸鼠实验表明，LincRNA-ROR沉默导致PCSCs的肿瘤发生率显著低于对照组。致癌机制研究发现，LincRNAROR可能作为ceRNA发挥作用，其通过干扰miR-145的功能而激活核心转录因子Nanog的表达。Nanog和LincRNA-ROR的表达都与PCSCs中的miR-145水平呈负相关，抑制LincRNA-ROR的表达能促进内源性miR-145上调及沉默Nanog的表达。LincRNA-ROR、miR-145和Nanog之间的上述关系可以定义为相互竞争、相互制约，平衡这种“LincRNA-ROR-miR-145-Nanog”关系是PCSCs维持其高增殖、侵袭和肿瘤发生率的重要机制之一。总之，在胰腺癌中LincRNA-ROR低表达可以抑制细胞增殖、侵袭和肿瘤发生，LincRNA-ROR在调控多重致癌性和胰腺癌进展方面发挥着直接作用。因此，LincRNA-ROR是预测胰腺癌患者术后临床结果的一种新的预后标志物，也可能是治疗的合理靶点。

3.3 LincRNA-ROR与乳腺癌（breast cancer，BC）

BC是最常见的癌症类型，也是女性癌症相关死亡的第二大原因，全球每年约100万新增病例，超过40万人死亡。Hou等[18]发现LincRNA-ROR可能是EMT的重要调控因子，通过调控miRNA表达，促进乳腺癌进展和转移。该研究表明乳腺肿瘤标本中LincRNA-ROR上调，且能增强乳腺癌细胞的迁移和侵袭。相反，沉默的LincRNA-ROR抑制乳腺肿瘤生长和体内肺转移。LincRNA-ROR作为miR-205的ceRNA，通过抑制miR-205的表达而降低其对靶基因ZEB1和ZEB2的抑制作用，进而促进EMT的过程。因此，LincRNA-ROR作为EMT的重要调节因子，可以通过调控miRNAs促进乳腺癌的进展和转移。同时提示LincRNAROR可能是侵袭性和转移性乳腺癌的治疗靶点。

Wan等[24]研究发现LincRNA-ROR可以作为一种诱饵oncoRNA来促进雌激素受体（estrogen receptor，ER）阳性乳腺癌的雌激素独立生长。在雌激素缺乏的情况下，LincRNA-ROR会导致磷酸化MAPK/ERK通路的上调，进而激活ER信号。当LincRNA-ROR敲除后，雌激素缺失诱导的ERK激活和ER磷酸化消失，而LincRNA-ROR的重新表达可恢复上述所有表型。此外，还发现双特异性磷酸酶7（DUSP7）参与了LincRNA-ROR敲除诱导的MAPK/ERK信号抑制。LincRNA-ROR敲除增加了DUSP7的蛋白稳定性，抑制ERK磷酸化。临床数据分析显示，ER阳性乳腺癌样品中DUSP7表达低于ER阴性乳腺癌，且DUSP7表达下调与患者生存状况不佳有关。

3.4 LincRNA-ROR与三阴性乳腺癌（triple-nega⁃tive breast cancer，TNBC）

TNBC约占BC病例的20%，特别是在年轻女性中经常发生。临床上常常通过全身性治疗来降低TNBC的特异性死亡率，但其复发率和转移率仍然高，这意味着急需开发有效的治疗方法。Eades等[25]研究发现LincRNA-ROR在TNBC细胞系和组织样品中上调，其作为miR-145的ceRNA过表达，并下调miR-145的表达，进而调控三磷酸鸟苷（GTP）结合蛋白ARF6的表达，影响肿瘤细胞的黏附和转移。miR-145下调是TNBC的一个标志，miR-145并不影响增殖或凋亡，而是调控肿瘤细胞的侵袭，且对参与肿瘤侵袭的miR-145调控通路的研究发现了一个新的靶点GTP结合蛋白ARF6。ARF6是一个已知的乳腺肿瘤细胞侵袭的调节因子，在TNBC和BC转移中被显著上调。ARF6的过表达导致E-钙黏蛋白定位丢失，细胞连接中断。这些研究结果揭示了LincRNA-ROR/miR-145/ARF6通路调控TNBC的侵袭。

Ma等[26]发现LincRNA-ROR/miR-145与TNBC细胞系MDA-MB-231中的靶基因MUC1相关。Mucin1（MUC1）是黏蛋白（mucin）家族的一员，通常在腺器官中表达。在乳腺癌中，MUC1通过诱导EMT增强癌细胞的侵袭性，其表达增加与淋巴结转移和预后较差有关[27-28]。据研究，LincRNAROR的异常表达会增加MDA-MB-231细胞的侵袭转移和功能丧失。LincRNA-ROR作为ceRNA作用于miR-145，上调MUC1的表达且影响E-钙黏蛋白膜的定位，进而诱导EMT增强癌细胞的侵袭性。综上，LincRNA-ROR/miR-145参与调控TNBC细胞侵袭和迁移的靶基因MUC1，提示Lin⁃cRNA-ROR可能是TNBC潜在的治疗靶点。

4 结语

本文初步探讨了LincRNA-ROR在癌组织中的异常表达，及其在癌细胞增殖、迁移及侵袭等生物学功能中的重要调节作用。许多证据表明，LincRNA-ROR是一种有效的肿瘤启动子，在不同的癌症中存在异常的表达。其肿瘤促进功能可归因于其调控的靶基因涉及多种途径，包括增殖、侵袭、血管生成和癌症干细胞。LincRNAROR与许多信号通路密切相关，因此，要全面了解LincRNA-ROR的生物学作用，还需要发现新的靶点。LincRNA-ROR与肿瘤的恶性生物学行为明显相关，这为进一步筛选肿瘤分子标志物奠定了基础，同时也为肿瘤寻找分子治疗靶标提供了依据。然而，有关LincRNA-ROR在肿瘤发生、发展中的分子调控机制，有待进一步深入研究。

LincRNA-ROR在众多肿瘤中异常表达，可作为一些肿瘤早期筛查诊断依据。通过RNA干扰等实验技术影响其在肿瘤组织中的表达，从而引起肿瘤细胞增殖、分化、转移、凋亡等生物学行为以及对化疗药物敏感性的改变，为肿瘤的靶向治疗及疗效评估提供新思路。目前对LincRNAROR的研究尚处于初级阶段，其作用机制等尚不明确。随着研究的深入，相信LincRNA-ROR在肿瘤诊断、治疗及预后中将发挥重要作用。