铜绿假单胞菌OprF/I融合蛋白疫苗研制现状

梁诚诚，李文桂

重庆医科大学附属第一医院 传染病寄生虫病研究所，重庆400016

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，Pa）是一种革兰阴性非发酵和需氧的机会性致病菌，其表型多样，广泛存在于自然界和人类生活环境中，常感染免疫防御机制受损的患者，如囊性纤维化、严重烧伤和肿瘤病人[1]。Pa也是医院获得性感染的主要病原体之一，尤其是在烧伤科和ICU，感染后住院时间较长、医疗费用较高，甚至危及生命[2-3]。Pa具有强大主动外排机制协同外膜屏障作用的天然抗性，加之抗生素滥用所致多药耐药性增加，共同造成了发病率和死亡率的升高，是治疗的一大挑战[4-5]。随着抗生素耐药的使用限制和新抗生素的开发缓慢，补充和替代方案日益受到关注，其中疫苗成为防治Pa感染的有效替代方法。

随着Pa疫苗的持续研发，许多抗原如外膜蛋白、脂多糖、鞭毛、菌毛、外毒素A等成为研究者用于Pa疫苗设计的靶抗原。在大多数研究中，这些靶抗原开发的疫苗能不同程度地降低免疫小鼠Pa感染的发病率，提高存活率，产生一定的保护力[6-7]。其中，用外膜蛋白（outer membrane pro⁃tein，Opr）F或I作为免疫原进行免疫接种可在动物模型或人体临床试验中引发交叉反应和特异性免疫应答，是有潜力的疫苗候选物[8-9]。为增强疫苗协同免疫效果，开发了基于OprF和OprI保护性抗原的重组OprF/I融合蛋白疫苗[10]，目前已进入Ⅱ期临床试验[11]，具有极大的研究价值。我们拟就OprF和OprI的特性、重组抗原疫苗、DNA疫苗以及重组沙门菌疫苗的研制现状进行综述。

1 外膜蛋白F和I的特性

外膜蛋白镶嵌在Pa脂多糖和磷脂层外膜上，是细胞表面的孔蛋白和其他结构功能组分。OprF和OprI是Pa表面暴露和抗原高度保守的2种重要的外膜蛋白[12]。OprF是Pa细胞表面非特异性通道孔，富含β螺旋结构。其基因全长1157 bp，存在1050 bp的开放读框（ORF），编码326个氨基酸残基的蛋白质。OprF离子通道存在少数单域构象异构体和多数双域构象异构体的2种构象，其中单域构象异构体的缺乏和该构象异构体中弱导电亚构象与OprF的低渗性有关[13]。通过调节群体感应网络，OprF参与Pa的毒力作用，其与α干扰素结合刺激群体感应依赖性毒力因子的表达，如Ⅲ型分泌系统（T3SS）分泌的ExoT和ExoS毒素、PA-1凝集素，以及抑制囊性纤维化纤毛搏动的Lec复合物凝集素基因[14-16]。另外，外膜囊泡发挥包装蛋白质、小分子和DNA并递送至原核和真核细胞的作用，OprF可通过调节假单胞菌喹诺酮信号（PQS）水平影响外膜囊泡的形成[17]。研究表明，采用无细胞表达系统表达OprF孔蛋白，其功能表征能稳定结合在脂质双层膜中，有助于分析OprF的结构和功能[18]。已证实OprF在Pa所有致病和环境菌株中可作为安全的保护性免疫原，是Pa疫苗研制的重要候选物[19-20]。

OprI是Pa细胞外膜的内单层中的一种脂蛋白，富含α螺旋结构。其基因全长625 bp，ORF为249 bp，编码64个残基的成熟蛋白质。OprI是疫苗接种的良好载体分子，与抗原呈递细胞（APC）和上皮细胞的TLR2/4作用，末端脂质尾部可引发免疫反应，其与气管和小肠上皮的黏附有助于黏膜蛋白疫苗的开发[21-22]。OprI是阳离子抗菌肽（cationic antimicrobial peptides，AMP）的新靶点，参与Pa对hRNase7和α螺旋阳离子AMP的敏感性，通过抑制其抗菌活性，增大细菌细胞膜的渗透性而发挥作用，可用于耐药性Pa感染的药物筛选[23-24]。此外，Basto等[25]提出了一种新的大肠杆菌克隆系统，表达和克隆与OprI脂蛋白融合的异源抗原，故将OprI锚定在3种细菌细胞壁上，利用该系统可获得重组细菌细胞壁衍生的免疫原性制剂，有望用于新疫苗的开发。

OprF/I是利用DNA重组技术将OprF的C端序列和整个OprI抗原决定簇融合的重组外膜蛋白。OprF/I融合蛋白是一种高度保守的保护性抗原，也是良好的Pa疫苗候选分子[26]。在人体试验中，Mansouri等[27]用OprF/I融合蛋白免疫健康志愿者，发现其诱导产生促进补体结合和具有调理活性的特异性抗体。随后相继证实了重组OprF/I蛋白在病理的烧伤和囊性纤维化患者模型中也具有良好的免疫原性和耐受性，产生抗Pa感染的保护效力[28-29]。

2 重组抗原疫苗

重组抗原疫苗是利用DNA重组技术将保护性抗原基因插入表达载体而制备的重组蛋白。由于不含病原体的其他感染性成分，其具有高安全性、低成本、可大量生产等优点。Ding等[30]编码Pa的Met-Ala-（His）6OprF190-342-OprI21-83融合蛋白并在大肠杆菌中表达，分别制备已接种重组疫苗获得OprF/I特异性抗体的人血清、兔血清和小鼠血清。ELISA检测人、兔和鼠血清中OprF/I特异性IgG水平，结果表明3种类型血清均可诱导特异性抗体产生，其中鼠血清中的IgG水平最高。免疫印迹证实OprF/I疫苗可产生特异性免疫应答，血清能识别Pa的OprF和OprI蛋白。此外，结合与抑制试验发现重组OprF/I和Pa以剂量依赖性方式与人的IFN-γ结合，而不结合鼠IFN-γ，OprF/I疫苗接种的人血清显著抑制Pa与IFN-γ的结合，提示OprF/I疫苗可以从另一机制阐明其抗Pa感染的保护作用。

Westritschnig等[31]编码Pa OprF和OprI的保 护性表位，在大肠杆菌中表达重组杂合蛋白Met-Ala-（His）6OprF190-342-OprI21-83，即构建IC43疫苗。将受试者随机均分至5个治疗组（50、100或200 μg IC43含佐剂，100μg IC43不含佐剂，安慰剂组），2次间隔7 d肌注接种。ELISA分析免疫原性，显示免疫后2周，各治疗组组间的OprF/I特异性抗体水平存在显著差异，4个IC43治疗组较安慰剂组诱导免疫应答增强，并且在所有IC43治疗组中＞90%的受试者的OprF/I特异性IgG水平增加≥4倍，有42.6%观察到50倍水平的增加，免疫后3～6个月，各组IgG水平逐渐下降，但仍比安慰剂组高。调理吞噬测定（OPA）评估抗体功能性表明，免疫后2周，54.5%的IC43治疗受试者的OPA滴度增加≥2倍，其OPA比值与OprF/I特异性IgG抗体存在相关性，观察抗体亲和指数发现，免疫后2周，所有IC43治疗组＞96%的受试者可检测到OprF/I特异性IgG抗体，且抗组氨酸IgG抗体水平可增加到最大，54.5%的IC43受试者抗体水平增加≥4倍，免疫后3个月开始下降。免疫后6个月，在所有IC43治疗组中仍可检测到ASC反应的特异性IgG抗体。疫苗安全性评估表明IC43疫苗安全耐受，最大耐受剂量为400μg。另外Ⅱ期临床研究表明，IC43疫苗在机械通气的ICU患者中产生了显著的免疫原性，初免后2周诱发更高水平的特异性抗体，IC43免疫各组之间的Pa感染率无明显差异[11]。

Cui等[32]以Pa标准株（ATCC27853）基因组为模板，扩增外膜融合蛋白OprF190-342-OprI21-83的663 bp基因，将其插入载体pGEX-2T-1，经纯化和去除GST标签，表达可溶性无标签的外膜融合蛋白FI，将甘露糖修饰的壳聚糖（MC）制成微球（MPs），采用三聚磷酸盐离子交联法构建甘露糖修饰的壳聚糖微球载体疫苗（FI-MCS-MPs）。共聚焦和免疫组化结果表明FI-MCS-MPs结合巨噬细胞甘露糖受体。分别用30μg FI溶液、FI-AL、FI-CS-MP、FI-MCS-MPs鼻滴免疫BALB/c小鼠，检测产生的FI特异性抗体水平，结果显示肺组织浆液早期产生局部IgM抗体，鼻洗液、BAL和肠道灌洗液中免疫中后期均可产生较高水平的IgA，整个免疫过程中，FI-MCS-MPs组与FI-CS-MP组无显著差异；而在全身性免疫应答中FI-MCSMPs组的血清IgA和IgG水平在免疫后6周显著增加，且高于其他免疫组水平。FI-CS-MP组和FIAL组产生更多IgG1，倾向于Th2反应；而FIMCS-MPs组显示高IgG2a/IgG1比值，提示倾向产生Th1反应。FI-MCS-MPs免疫组还可激活肺和脾组织中的T淋巴细胞亚群，刺激IFN-γ和IL-4的高表达，提示诱导免疫小鼠产生混合Th1/Th2应答。此外，用1.8×109CFU/mL的Pa对免疫小鼠进行鼻内致死性攻击，FI-MCS-MPs免疫组显示75%的最高存活率，对Pa感染产生明显保护作用，但与FI-CS-MP组无显著差异。

Weimer等[33]将PA01株的OprF311-341、OprI21-85和鞭毛蛋白Flic的基因亚克隆到质粒pET29a，构建重组质粒OprF311-341-OprI-flagellins并在大肠杆菌中表达融合蛋白。用5μg融合蛋白肌肉注射免疫BALB/c小鼠，4周后加强1次，加强后2周采血。检测结果显示，免疫小鼠血清诱导高水平和高亲和力的抗原OprF、OprI和鞭毛蛋白的特异性IgG抗体，但未产生可检测的IgE抗体；IgG亚类结果显示高水平的IgG2a和主要以IgG1为主的免疫反应；融合蛋白可刺激大量浆细胞产生，15%在脾脏，85%在骨髓，且在骨髓中鞭毛蛋白的浆细胞数高于OprF和OprI的浆细胞数；对3种抗原产生的IgG抗体具有相等水平的相对亲和力；产生的特异性IgG具有高功能活性，促进最高水平的IgG依赖性C3广泛沉积；免疫血清显示融合蛋白能有效激活补体活性，增强杀伤非黏液性Pa的能力，但杀伤黏液性Pa的能力较弱，仅18%。用3.5×106CFU的琼脂糖嵌入的PA01株呼吸道攻击疫苗免疫后的DBA/2小鼠，攻击后1、3和5 d收集肺组织并计数细菌负荷，结果表明，与对照组相比，免疫小鼠的细菌负荷明显下降，显示出最轻的肺组织病理损伤，攻击后5 d组织即恢复正常，减轻继发性组织损伤。这些研究在用该疫苗免疫的年轻非洲绿猴中也得到证实[34]，提示该融合蛋白疫苗是有望用于人类的潜在疫苗。

3 DNA疫苗

DNA疫苗又称核酸疫苗，是将抗原编码基因克隆到质粒DNA，将构建的重组质粒经注射途径等进入机体，使重组质粒在真核细胞中表达保护性抗原，从而诱发机体特异性免疫反应。DNA疫苗制备简单，便于保存，可多次免疫且免疫应答持 久。Staczek等[35]将融合基因OprF/I插入pVR1020，构建重组质粒pVR1020O-OprF/I，用1 μg pVR1020或重组质粒经基因枪免疫B淋巴细胞功能缺陷的B（-）和功能正常的B（+）小鼠，共免疫3次，间隔2周。末次免疫后2周，用1.2×103～2.2×103CFU的FD4菌株攻击小鼠左肺，攻击当天，ELISA检测免疫小鼠血清对OprF和Pa菌株的细胞反应，攻击后8 d评估肺组织的病变程度，流式细胞仪检测肺和脾组织的细胞群及血清细胞因子。结果发现，B（-）免疫组和pVR1020免疫B（+）组血清不与OprF、FD2、FD4和KG1077反应，而F/I免疫B（+）组均可与其全部反应并产生OprF和OprI特异性抗体；攻击后8 d，F/I或pVR1020免疫B（+）组的严重损伤比例分别为44.0%和68.2%，表明F/I免疫B（+）组显示出增强的保护力，而F/I或pVR1020免疫B（-）组间保护力无明显差异，且与F/I免疫B（+）组相当；与B（+）免疫组相比，B（-）免疫组在肺和脾组织中显示更高水平的CD3+细胞，中性粒细胞在B（-）和F/I免疫B（+）组的脾组织中数量更多；F/I免疫B（-）和B（+）组的INF-δ水平均显著升高，INF-ɑ在F/I免疫B（+）组中轻微升高，其余IL-10、IL-5、IL-4在攻击前后无明显变化，表明细胞免疫在抗Pa感染中起重要保护作用。

Saha等[36]以PA01株基因组为模板扩增OprF/I、PcrV和PilA基因，分别插入pGACAG，构建重组质 粒pGACAG-OprF/I、pGACAG-PcrV、pGACAGPilA并在大肠杆菌DH5中表达。分别用100μg pGACAG-OprF/I和上述3种重组质粒组成的混合疫苗于0和28 d经肌肉注射免疫BALB/c小鼠，初免后0、2、4和6周收集小鼠血清，免疫印迹检测血清抗体特应性，ELISA检测特异性抗体水平。结果表明，免疫鼠血清能特异识别OprF、OprI、PcrV和PilA蛋白，诱导产生的血清IgG、IgG1和IgG2水平在pGACAG-OprF/I组和多价混合疫苗免疫组中无显著差异，提示多价混合疫苗易产生多价抗体且抗原间无免疫干扰。末次免疫后2周，用5×105CFU的D4鼻内接种攻击小鼠，发现多价混合疫苗组的肺组织和鼠血清中的细菌清除率最高；用2×LD50的PAK或D4鼻内攻击小鼠后10 d，发现多价混合疫苗组的存活率明显高于其他免疫组，分别为100%和90%。纯化各免疫组的血清特异性IgG，其与2×LD50的PAK或D4株混合后鼻内接种幼稚小鼠，10 d后发现多价混合疫苗组的存活率仍最高，分别为100%和80%，表明多价混合疫苗可诱导产生较好的免疫保护力。

4 重组沙门菌疫苗

重组沙门菌疫苗是将病原体的保护性抗原基因导入减毒的沙门菌中，重组菌苗接种后在体内增殖而表达大量所需抗原，刺激机体产生相应免疫抗体。这类疫苗抗原不须纯化，增强免疫效果，接种方便。Arnold等[37]将OprF/I融合蛋白基因插入质粒pMW151、pMW209和pMW210后，重组质粒转入aroA突变鼠伤寒沙门菌减毒株SL3261，构建重组OprF/I融合蛋白减毒沙门菌活疫苗。用109CFU/100μL重组疫苗菌液灌胃C57BL/6小鼠，接种7 d后计数免疫小鼠脾脏及肠系膜淋巴结中的沙门菌菌量，观察其感染率与重组疫苗蛋白表达水平的关系，免疫后28 d收集鼠血清、肠黏膜、支气管肺泡灌洗液和鼻洗液，检测诱导产生的OprF/I特异性抗体。结果表明SL3261（pMW151）可表达最高蛋白水平，但在组织中定植不良，未产生可检测到的系统或黏膜抗体；SL3261（pMW209）表达最低蛋白水平，感染率最高，诱导小鼠产生以IgA为主的中等程度的系统性免疫应答，其中黏膜免疫反应相对较弱；SL3261（pMW209）显示中等水平蛋白表达和细菌感染率，在MLN中感染率略增加，在鼠血清中可获得高水平的IgG和IgA，肠黏膜及鼻洗液中也可诱导中等程度免疫反应，但未在肺组织中检测到有关抗体。此外，还探讨了SL3261（pMW209）在初次黏膜免疫后4周肌注重组疫苗系统加强免疫接种的联合策略优于单纯黏膜、单纯系统免疫接种方式，可增强上、下呼吸道黏膜的免疫原性，诱导高水平的IgA、IgG和IgG2a水平，并保留单纯黏膜免疫接种产生的Th1免疫反应。

Bumann等[38]将Met-Ala-（His）6OprF190-342-OprI21-83的融合基因插入载体Pyz或PpagC，重组质粒导入伤寒肠沙门菌菌株Typhi Ty21a的thyA突变体或基因缺失突变的减毒株CVD908，构建重组蛋白OprF/I沙门菌口服减毒活疫苗。免疫印迹证实单克隆抗体识别重组菌苗表达的重组蛋白。用制备的沙门菌菌株Typhi Ty21a或CVD908疫苗于第0、2和4 d口服免疫受试者，28 d后全身系统加强免疫1次，同时用融合蛋白OprF/I的全身肌注接种疫苗和鼻套管接种疫苗。在初免后0 d、4周和6周收集受试者血清和诱导痰，ELISA检测其OprF/I特异性抗体。结果表明，单纯初次口服重组疫苗未明显诱导血清特异性抗体产生，而所有免疫组在全身系统加强后均可产生相当的高血清IgG和IgA抗体水平；在支气管中，鼻和口服免疫组显示出升高的特异性抗体水平，其中IgA抗体显著，系统加强前后及口服免疫组间的抗体水平无明显差异，而全身疫苗免疫组在初免后未产生明显特异性抗体，仅在系统加强后有所增加，免疫反应较弱，提示较全身疫苗接种，鼻和口服疫苗更有助于诱导下呼吸道免疫应答保护。

Zhang等[39]以ZHDL9菌株基因组为模板，扩增F1和I2基因并插入质粒pYA-F1I2，经电穿孔转入ΔasdLH430感受态细胞（PQ），构建重组鼠伤寒沙门菌PQ（pYA-F1I2）疫苗，F1I2融合蛋白能在重组菌中有效表达。分别用2.0×1010CFU重组PQ（pYA-F1I2）灌胃、2.0×108CFU重组PQ（pYAF1I2）皮下注射和25μg His-F1I2加氢氧化铝佐剂首次免疫加2周后皮下注射免疫小鼠，并在免疫后24、34和44 d进行眼眶取血，收集肠黏液、肺组织及脾淋巴细胞。EILSA检测发现皮下注射组血清中能诱导产生高于口服灌胃组、与His-FII2免疫组相当的高IgG水平及肺组织内的最高IgG水平；皮下注射组的IgA水平明显高于口服灌胃组，但在肠液中结果相反，而肺组织内的IgA只在皮下注射组产生。His-F1I2免疫组均未诱导任何可检测的IgA。免疫后44 d，与其余免疫组相比，皮下注射组产生更多IL-4、IFN-γ、CD4+T细胞和更高CD4+/CD8+比值，提示其可诱发Th1/Th2混合型细胞免疫反应。用5.0×107CFU的ZHDL9强毒力菌株滴鼻攻击初免后30 d的免疫小鼠，攻击后15 d显示皮下注射组、口服灌胃组及His-FIL2免疫组的小鼠存活率分别为77.78%、41.18%、66.67%，表明皮下接种重组PQ（pYAF1I2）途径能产生更有效的免疫保护。

5 结语

目前，针对Pa感染的许多不同种类的疫苗已进入动物或临床试验阶段，得到了一些有价值的实验数据和结果，但尚未获得许可进入市场的疫苗[40]。大部分关于铜绿假单胞菌OprF/I融合蛋白疫苗的研究表明该疫苗安全耐受，诱发具有交叉保护力的特异性免疫反应，其主动或被动免疫在Pa感染的各种动物模型或部分临床试验中产生有效保护作用。尽管OprF/I融合蛋白可能是目前最有前景的抗原之一，但这类疫苗的安全性和有效性方面仍存在不少问题：动物实验模型并不能完全准确地模拟人体感染系统，其测试候选疫苗的结论有待验证[41]；现有临床试验中的疫苗保护力仍低于人们预期水平；尚不清楚疫苗清除Pa感染的保护机制和诱导的免疫应答类型[42]；未明确疫苗的不良反应；疫苗接种的最佳给药途径、剂量及间隔次数仍有待摸索；未提出规范和标准的疫苗效果评价方案。

分子免疫学和基因工程技术的不断发展提供了更多的思路用于疫苗的研发。而多抗原、多抗原表位的联合和多基因的融合仍是Pa疫苗的重要研究趋势和方向。一方面，要积极解决上述现有疫苗存在的问题，可寻找有效的佐剂或其他载体来改进疫苗的安全性和保护效力，如新发现的两岐双歧杆菌（Bifidobacerium bifidum）疫苗载体[43]；另一方面，又要进一步研究Pa的生物学特性和致病机制，鉴定新的候选抗原以研制新型疫苗，如抗生素外排泵的表面成分、伴侣通路成分等[44]。相信随着研究的不断深入，针对Pa感染的市场生产疫苗指日可待。