纳米佐剂在抗病毒疫苗中的应用

梁皓，胡秦，盛望

北京工业大学 生命科学与生物工程学院，北京100124

1796年，爱德华·詹纳发现接种牛痘可以预防天花的发生，这种预防方法随后被广泛传播，世界上第一种有效的疫苗由此诞生。在之后的200多年中，针对多种病毒的疫苗得以快速发展，并在许多流行病的预防与控制中取得成功。目前的疫苗主要为减毒活疫苗、灭活病毒疫苗和亚单位疫苗。减毒活疫苗保存条件严格且自身存在一定毒力，有导致疾病本身的风险，而灭活病毒疫苗和亚单位疫苗与之相比免疫原性较弱，需要多次免疫[1]。纳米材料在疫苗领域中的应用有效地解决了免疫持续时间短与免疫原性差的问题，纳米佐剂疫苗将成为未来疫苗研究的新趋势。在此，我们简要综述了纳米佐剂的特点与类型，及其在艾滋病、乙型肝炎、流感等病毒相关性疾病中的应用。

1 纳米佐剂的特点

纳米佐剂是一种可以递送抗原，增强抗原免疫原性并防止抗原被酶提前降解的尺寸为1～1000 nm的纳米颗粒[2]。纳米佐剂的尺寸是影响它免疫原性的重要因素之一。纳米疫苗从外周血有效进入淋巴节会提高抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC）对纳米疫苗的摄入，而物质进入淋巴管取决于其尺寸，20～200 nm的物质可以轻松地通过淋巴管进入淋巴结[3]。实验证实，小分子聚合物纳米颗粒（25 nm）在注射进小鼠体内后可以到达淋巴节并停留至少120 h，且观察到巨噬细胞与树突状细胞（dendritic cells，DC）对纳米颗粒的摄取，证明纳米颗粒的尺寸影响其在小鼠体内二级淋巴系统中的动力学分布[4]。

纳米佐剂易于生产和可增强免疫原性的特点，使其成为一个极具吸引力的用于递送抗原的平台。单一的抗原可以重复地展示在纳米颗粒的表面，这是免疫佐剂可以增强免疫原性的另一个重要原因。不仅如此，纳米佐剂还可以同时包裹多种抗原形成多价疫苗，或者同时将抗原与其他佐剂（如CpG ODN、Poly I∶C等）组装在一起，大幅度地增强了体液免疫与细胞免疫的效果。Tao等将M2e多肽和CpG结合到金纳米颗粒上形成纳米疫苗，用来预防甲型流感病毒[5]。实验结果证实，在小鼠体内，这种纳米疫苗引起了很高的抗M2e的抗体水平，IgG1和IgG2a均有大幅提高。在多个甲型流感病毒毒株的致死剂量下，免疫了纳米疫苗的小鼠得到了100%的保护，从而证明此疫苗有着优秀的广谱预防效果。

2 纳米佐剂的种类

关于纳米佐剂的选择，首先应考虑的是需要包装与递送的抗原类型。目前已发展出多种材料可以作为纳米佐剂，这些材料分为无机与有机两大类。无机材料包括金纳米颗粒、碳纳米颗粒等。它们有很多优点，如材料性质均一稳定，有一定的结构硬度等，但是在体内，无机纳米材料不容易降解，会引起持续的炎症，最终导致细胞纤维化[6]。

相对而言，有机材料容易降解，不存在细胞毒性，由此发展出了多种纳米佐剂。脂质体是其中最常用的一种，它可以将病毒抗原包装在脂质体内，通过膜融合使抗原进入细胞[7]。壳聚糖已被批准作为辅药用于多种试剂中，显示出良好的耐受性与安全性，可作为纳米佐剂应用于黏膜免疫[8]。聚乳酸羟基乙酸共聚物（PLGA）是一种可生物降解的高分子材料，可以有效地保护包装在内的抗原与佐剂，免除酶的破坏，起到长期的缓释递送效果[9]。

3 纳米佐剂的应用

3.1 人免疫缺陷病毒

人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）是导致艾滋病的元凶，是全球范围内对人类健康危害最为严重的传染病之一[10]。纳米佐剂联合传统的HIV疫苗是预防和治疗艾滋病的有效手段[11]。首先，纳米佐剂提供了一个更好的递送途径，可以帮助HIV疫苗更有效地通过体内的物理屏障；并且纳米佐剂的缓释作用可以提高HIV疫苗的半衰期，延长体内的循环时间。其次，纳米佐剂本身干扰HIV的组装过程，从而抑制HIV复制。最后，纳米佐剂可以减轻HIV药物或疫苗带来的毒副作用[12]。

功能化的金属材料，如金、银、铂，都可以成为递送HIV疫苗的纳米佐剂。在少数HIV广谱单克隆抗体中，2G12是惟一的碳水化合物靶向的抗体，它可以识别病毒包膜蛋白gp120表面高聚甘露糖[13]。Marradi等设想用寡聚甘露糖苷包裹的金纳米颗粒发展成一种疫苗，希望能够诱导出2G12样的抗体，干扰HIV通过gp120介导进入细胞[14-15]。这种纳米颗粒可以抑制2G12抗体与gp120的结合，并阻碍2G12抗体介导的HIV中和。Di Gianvincenzo等发现带负电荷的糖基化金纳米颗粒可以使gp120上V3多肽的α螺旋与β片层结构更加稳定[16]。与普通的V3多肽相比，纳米佐剂的使用使V3免受蛋白酶的降解而更加稳定。负载V3的纳米颗粒在兔子体内诱导出可以识别gp120重组蛋白的抗体，兔子体内的血清展现出持续的中和活性。这项研究为全合成HIV疫苗的设计提供了参考。

第一个使用脂质体递送HIV抗原的的研究已有20多年历史[17]，这种递送方式吸引了众多研究人员的目光。HIV脂质体纳米疫苗的成分、大小、脂质体的类型、HIV抗原和递送方式等都得到了大量研究。Philips等评估了不同脂质体成分对HIV免疫应答效果的影响[18]。结果显示，无论是二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）脂质体还是二肉豆蔻酰磷脂酰甘油（DMPG）脂质体都比传统的铝佐剂诱导出更强的HIV gp120特异性IgG抗体。

聚交酯（PLA）是一种很好的生物医药材料，也是最常用的一种HIV疫苗递送聚合物。Lamal⁃le等将HIV p24抗原与gp120包膜糖蛋白共同吸附在PLA纳米颗粒表面，发现纳米颗粒表面抗原的免疫原性被很好地保留下来，并且这种PLA纳米疫苗可比MF59诱导出更强的抗体滴度[19]。Cli⁃ment等同样用PLA包载HIV Gag抗原p24制作出的纳米颗粒可以诱导DC成熟，细胞因子和趋化因子分泌，增加HIV特异性CD8+T细胞的扩增[20]。

此外，PLGA也可作为纳米佐剂用于HIV疫苗。Zhou等用PLGA和聚乙烯亚胺（PEI）形成包含HIV DNA疫苗的纳米微球。这种纳米微球能够改善DNA递送到APC的效果，并且在体外可以持续释放长达2周。PLGA纳米微球保护了DNA疫苗免受DNA酶的降解，显著提高了血清中的抗体水平和CTL的数量[21]。

3.2 乙型肝炎病毒

世界卫生组织评估世界上约有2.6亿乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）携带者。慢性HBV感染将会导致肝硬化甚至肝癌的发生[22-23]。目前，乙肝疫苗使用的是以氢氧化铝作为佐剂的HBV表面抗原（HBsAg）组成的病毒样颗粒（VLP）。但铝佐剂存在许多不足，它会引起炎症反应、自身免疫和神经系统损伤，并且诱导免疫反应偏向于Th2型，不适合需要CTL为主导的治疗方案[24-25]。初步研究表明，纳米佐剂可以帮助HBV疫苗更有效地递送抗原，诱导TH1型免疫反应，且减少佐剂带来的毒副作用。

其中一项研究用PLGA吸附HBsAg与TLR9激动剂CpG形成纳米疫苗[26]。当其通过肌肉注射进入小鼠体内后，不仅可以激活相关抗体的产生，诱导出HBsAg特异性CD8+T细胞，还检测到相关细胞因子与趋化因子分泌的提高。另一项同样使用PLGA作为纳米佐剂递送HBsAg的研究中[27]，发现此纳米疫苗可以显著增强血清中特异性抗体的分泌，在免疫纳米疫苗5周后，血清中抗HBs抗体浓度可达800 mIU/mL；而只免疫HBsAg不加PLGA纳米佐剂的小鼠血清中，特异性抗体的浓度只有不到100 mIU/mL。

感染HBV的成年人中只有5%～10%会发展成慢性肝炎，但是由母婴途径传播遭受HBV感染的新生儿约90%都会发展成慢性肝炎[28]。这是由于新生儿免疫系统中DC产生的IL-12水平较低，整体免疫反应偏向Th2型[29]。Pietrzak等用单磷酰脂质A（MPLA）作为纳米佐剂递送HBsAg[30]。这种纳米疫苗可以刺激新生儿脐带血来源的DC成熟并产生IL-12，成熟后的DC还可以进一步激活特异性T细胞扩增并分泌IFN-γ，而传统的HBsAg病毒样颗粒无这种效果。

3.3 流感病毒

目前，预防流感最有效的方式是接种三价流感灭活病毒疫苗（TIV）。TIV的免疫方式是肌肉注射，产生系统性免疫，黏膜免疫效果有限[31-32]。而流感主要通过飞沫传播，所以，最理想的流感疫苗应产生很强的呼吸道黏膜免疫反应。越来越多的研究开始关注通过加入纳米佐剂生产出适于黏膜免疫的流感病毒疫苗。

Dehghan等开发出一款通过鼻黏膜免疫的纳米疫苗[33]，他们用壳聚糖纳米佐剂包裹流感全病毒（WV）加上CpG共同免疫兔子，90 d后，兔子体内产生了大量IgA型血球凝集素抑制性抗体，同时检测到IL-2与IFN-γ的分泌提高，免疫效果明显优于单独使用WV。另一项研究用聚酐纳米佐剂包载H5血球凝集素三聚物（H53）产生预防H5N2的纳米疫苗[34]。用这种纳米疫苗免疫小鼠可以产生高水平的抗体滴度并增强CD4+T细胞的反应。当用致死剂量的病毒感染免疫后的小鼠时，纳米疫苗免疫后的小鼠得到良好的保护。Singh等发现用纳米佐剂将疫苗制成气溶胶可以产生良好的黏膜免疫效果[35]。在这项研究中，福尔马林灭活的H9N2病毒与CpG共同包载到PLGA中。与灭活病毒相比，此种方法形成的纳米疫苗可以在呼吸道黏膜表面停留更长时间，产生更强的血球凝集素抑制性抗体。

3.4 肠道病毒71型

肠道病毒71型（EV71）是手足口病（hand,foot and mouth disease，HFMD）的主要病原体之一[36]。过去的20年中，由EV71引起的HFMD在亚太地区广泛流行，严重威胁儿童生命健康[37-40]。尽管通常HFMD病情温和，但也有一些病人会产生严重的神经系统和心脏系统并发症，最终危及生命[41]。

γ聚谷氨酸（γ-PGA）是一种水溶性的可生物降解的多聚物，Pathinayake等选用γ-PGA与壳聚糖组装成的纳米佐剂（PC）负载EV71灭活病毒生成一种全新的纳米疫苗[42]。经皮下注射后，高水平的体液免疫与细胞免疫被诱导出来，病毒特异性的抗体与细胞因子（IFN-γ和IL-4）均大幅提升。与单独免疫灭活病毒相比，这种纳米疫苗产生了更加强烈、持续的免疫效果，并且未观察到有任何毒副作用。

除EV71灭活病毒外，EV71亚单位疫苗也得到了广泛的开发。由于亚单位疫苗的免疫原性较差，纳米佐剂的使用显得更加重要。Qiao等将壳聚糖与肝素组成纳米佐剂，共递送EV71的VP1多肽和CpG或肿瘤坏死因子α（TNF-α）[43]。由于形成的纳米疫苗尺寸分布可以控制在90～130 nm之间，所以经皮下注射后，纳米疫苗可以进入淋巴结并停留很长时间。这种策略增强了疫苗的免疫效果，不仅诱导出很强的Th1型免疫反应，还拥有不错的Th2型免疫效果。此外，EV71特异性IgA的分泌水平显著提高，证明这种疫苗既可产生系统性的免疫反应，也有优秀的黏膜免疫保护效果。

4 结语

纳米佐剂可以延长抗原在体内的停留时间，保持抗原的稳定性，增强抗原的免疫原性。因此，纳米佐剂疫苗有很大的潜力发展成为病毒预防与治疗的最佳手段。不同免疫调节剂或模式识别受体相关的激动剂与纳米佐剂的联合使用，将让疫苗的免疫效果得到进一步的提升。目前，为了清晰地理解纳米佐剂的免疫调剂机制，大量临床前研究与临床研究正在火热进行中。随着研究的深入，纳米佐剂将为病毒疫苗免疫提供一个更加安全有效的递送系统。