肠道病毒组与人体健康研究进展

陶万银, 朱 书

(中国科学技术大学 生命科学与医学部 中科院天然免疫与慢性疾病重点实验室合肥微尺度物质科学国家研究中心分子医学部， 合肥 230026 )

肠道微生物对疾病和健康的影响越来越受到人们的重视。肠道中生活着包括原核生物细菌、古细菌、真核生物真菌、原生动物以及无细胞结构的病毒等多种微生物。当前对肠道微生物的研究以肠道细菌为主，人们已经认识到包括多种自身免疫性疾病、代谢性疾病、神经系统疾病、肿瘤等多种疾病的发生、发展和治疗都与肠道菌群有关[1]。病毒是指没有细胞结构，依赖宿主细胞完成复制的一类生物。起先病毒是作为“致病因子”被发现的，也是导致许多重要人类疾病的病原体，如人类天花、流感、艾滋病及病毒性肝炎等多种传染病的致病原都是病毒。近年来随着深度测序技术的发展，人们认识到在健康人体中也存在大量的病毒。根据宿主不同，肠道病毒组包括真核DNA和RNA病毒，原核生物(包括细菌和古细菌)噬菌体，人类基因组中的内源性逆转录病毒元件(Endogenous retrovirus elements)等[2-3]。肠道病毒与人体免疫及疾病的关系也越来越受到重视，已经报道了包括炎性肠炎、肠癌、肠道感染等多种疾病的发生与肠道病毒相关[2-3]。

1 肠道病毒组的演化和稳态

肠道病毒包括内源性逆转录病毒元件；感染人类、肠道中的小型真核细胞，或者是作为食物来源的动物，植物的真核病毒；以及感染细菌的病毒，即噬菌体。根据形态观察正常粪便包含病毒样颗粒约108～109/g，其中绝大多数是噬菌体[4]。在出生后的最初几年中，由噬菌体和真核生物RNA和DNA病毒组成的病毒微生物组处于快速演化的状态，而成年后整体上是相对稳定的[5-6]。关于人类在胎盘中是否会接触到微生物还有争议，一般认为排除感染因素正常胎盘中不含有可检测到的微生物，肠道细菌是在出生后迅速获得[7]。Lim等研究了健康婴儿双胞胎的纵向队列中肠道病毒组和细菌微生物组，发现病毒组和细菌微生物组在同卵双胞胎之间比在不相关的婴儿之间更相似。从出生到2岁阶段，肠道真核病毒组和细菌微生物组扩大，相反，噬菌体病毒体组减少。噬菌体-细菌的关系呈动态变化，符合lotka-volterra捕食模型[8-9]。这一研究展示了婴儿微生物群具有高度的动态性，并且细菌、病毒和噬菌体的组成与年龄的变化有关[5]。

在成人中观察到微生物组相对稳定，并且宏基因组分析显示每个人的微生物组成都是独特的。Minot等通过宏基因组测序分析了一个成年个体超过2.5 年的病毒群落。在整个2.5年的研究期间肠道病毒组有80%持续存在，表明其长期的总体稳定性，而基因组的变异速率因病毒类型而异[6]。温和噬菌体(Temperate phages)的突变率相对较低，这与其在整合原噬菌体状态中通过细菌DNA聚合酶的精确复制有关。相反，单链环状DNA基因组的裂解性噬菌体Microviridae显示出高变异率(每天每个核苷酸 >10-5)，因此在该研究的2.5年期间累积的序列差异足以产生新的病毒株。由此可见，人类肠道病毒的多样性源于两个来源，即一小部分病毒在肠道内相对稳定存在，而另一部分来源于病毒的长期迅速进化[6]。

在宿主免疫状态发生变化时，会引发肠道病毒组也发生变化。一些病毒呈潜伏状态，在特定情况下会被重新激活。Reese等发现蠕虫感染小鼠后，会诱导产生白细胞介素-4(IL-4)和转录因子Stat6的激活，在体内重新激活鼠γ疱疹病毒(γ-herpesvirus)感染。IL-4通过诱导Stat6与重要的病毒转录激活因子的启动子结合，促进病毒复制并阻断宿主干扰素-γ(IFNγ)的抗病毒作用，表明处于潜伏状态的病毒已进化出了感知宿主免疫状态的机制[10]。类似的，蠕虫感染也会增强宿主对诺如病毒的易感性[11]。HIV感染后降低CD4+T细胞数量，削弱了机体免疫力[12]。Monaco等人对乌干达HIV感染患者的肠道病毒组和细菌微生物组进行了表征，分析比较了健康对照组，未治疗的HIV感染患者以及用抗逆转录病毒疗法(ART)治疗的HIV患者等人群的肠道病毒组和细菌微生物组，发现外周CD4+T细胞数量降低与肠道腺病毒扩增相关，并且这种增加与是否接受ART治疗无关。此外，CD4+T细胞数量较低的患者的肠道细菌多样性和丰富性降低，而一些特定的细菌丰度也发生变化，比如与炎症相关的肠杆菌科细菌的增加。因此，进行性HIV感染的免疫缺陷与肠道病毒组和细菌微生物组的改变有关，这一研究可能有助于认识和治疗AIDS相关的肠道疾病[13]。

2 病毒组介导肠道中的“跨界”相互作用

肠道病毒与肠道细菌、肠道中的真核生物和宿主细胞相互作用。这些复杂的原核生物和真核生物的“跨界”相互作用对人体的健康和疾病有着重要影响[14]。肠道病毒组包含能够感染各种真核或原核宿主的多种病毒，对介导“跨界”相互作用有着重要影响。真核病毒能够直接影响宿主免疫系统，导致一些看似无害的病毒也可能引起疾病。呼肠孤病毒(Reovirus)经常感染人和小鼠，尽管感染后没有明显症状，但会破坏宿主对食物抗原的耐受，导致乳糜泻(Celiac disease，CeD)。这是由于呼肠孤病毒感染抑制外周调节性T细胞(pTreg)转化，并且促进TH1细胞对膳食抗原的免疫应答，打破了肠道对食物抗原耐受，从而引发乳糜泻的发展[15]。

噬菌体能够增强细菌毒力，间接影响人体健康。伴随着细菌感染，噬菌体也大量出现在细菌感染部位。Sweere等分析了铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和它产生的丝状噬菌体Pf对细菌感染的影响，发现Pf噬菌体促进了铜绿假单胞菌在人的伤口感染。在小鼠模型中，当Pf噬菌体存在时，铜绿假单胞菌的在伤口的感染能力提高了50倍[16]。Pf噬菌体是单链DNA病毒，小鼠或人白细胞内吞后产生Pf噬菌体RNA，并触发TLR3-TRIF信号通路诱导I型干扰素IFNβ的产生，抑制肿瘤坏死因子(TNF)通路和宿主免疫细胞的吞噬作用。相应地，针对Pf的疫苗免疫后可防止小鼠铜绿假单胞菌伤口感染，表明针对病原相关噬菌体的疫苗接种也可能作为预防细菌感染的潜在策略[16]。

噬菌体也能够激活宿主肠道免疫信号通路。对在CD和UC患者的肠道病毒组深入分析显示，CD和UC与有尾目噬菌体(Caudovirales)的显著扩增有关，并且肠道病毒体的扩增和多样化可能并非是细菌群体的变化结果，而是导致其发生变化的原因[17]。Duerkop等从患有IBD的人类患者中分离出4株Caudovirales噬菌体用于抑制大肠杆菌的生长以治疗肠道肿瘤，在结直肠癌的小鼠模型中能够有效抑制肠肿瘤生长，显示出了很好的效果。分析显示，这些噬菌体通过TLR9依赖的干扰素应答通路激活肠道的免疫反应，引起小肠组织中几种促炎基因上调，也促进了肠道派氏结(Peyer′s patches)中CD4+和CD8+T细胞群的扩增。用纯化的噬菌体处理葡聚糖硫酸钠(Dextran sodium sulfate，DSS)诱导的结肠炎模型小鼠，会加重炎性肠炎症状[18]。这一发现给出了肠道噬菌体影响宿主免疫的直接证据。

病毒有可能会编码调控宿主代谢等功能的多肽，调节宿主功能。 Altindis等通过搜索美国国家生物技术信息中心(NCBI)的病毒/类病毒基因组数据库，在病毒基因组中寻找和62种人体肽激素、代谢相关细胞因子或生长因子等具有同源性的肽序列的存在。结果发现病毒携带与几种人类肽激素具有显著同源性的序列，包括胰岛素，胰岛素样生长因子(IGF)-1和-2，成纤维细胞生长因子(FGF)-19和-21，内皮素-1(endothelin-1)，抑制素(inhibin)，脂联素(adiponectin)和抵抗素(resistin)等。人工合成的病毒类胰岛素样多肽(VILP)能够与人或小鼠胰岛素受体或IGF1受体结合，刺激受体介导的信号传导，增加葡萄糖摄取，并激活细胞增殖。向小鼠静脉注射VILP可显著降低血糖，表明其在体内有活性[19]。

3 肠道病毒组与结直肠癌

结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)的发病与肠道微生物有关，结直肠癌患者与健康个体的肠道微生物组不同，包括肠道菌群[20]、肠道真菌[21]和肠道病毒等[22-23]。与健康对照组相比，结直肠癌患者肠道噬菌体群落的多样性显著增加。进一步临床亚组分析表明，肠道病毒组的失调与结直肠癌的进程有关，有20种以上的病毒属在患有结直肠癌的受试者和健康对照者之间有区别[22]。Hannigan等在结直肠癌患者粪便样本中鉴定出组成发生改变的病毒，主要是来自Siphoviridae和Myoviridae家族的噬菌体[23]。已经有多项研究报道了肠道细菌促进结直肠癌的发展[24-25]，有可能肠道病毒组通过改变宿主细菌来间接影响癌症进展[23]。至于肠道病毒是否以及如何直接影响结直肠癌的进展还有待进一步深入研究。

4 肠道病毒组与粪菌移植

通过粪菌移植(Fecal microbiota transplantation, FMT)的方法恢复肠道稳态已经开展了大量临床实验，对多种疾病显示出了不错的效果[26]。在评估粪菌移植的治疗效果和安全性时也需要重视肠道病毒在其中可能发挥的作用。一般认为FMT的治疗效果主要是恢复肠道菌群的多样性和稳态来达到治疗效果。考虑到肠道病毒组和菌群的相互作用及其对宿主的影响，肠道病毒组可能对粪菌移植的预后也会有影响。耐药性艰难梭菌感染(Clostridiumdifficileinfection, CDI)在采用FMT治疗后治愈率达到85%～90%[27-28]。通过对CDI患者肠道病毒组测序分析，Zuo等发现CDI感染患者肠道病毒组多样性也发生了显著变化。与健康对照组相比，CDI的受试者表现出明显较高的有尾噬菌体(Caudovirales)丰度和较低的有尾噬菌体多样性和均匀性。粪菌移植治疗导致CDI中有尾噬菌体的数量显著减少。临床观察发现，移植后供者来源的有尾噬菌体占受者肠道病毒组的比例与治疗效果呈正相关，提示在CDI粪菌移植治疗中肠道有尾噬菌体可能发挥了作用[29]。而噬菌体能够增强细菌感染毒力的发现也为粪菌移植的临床安全性提出了警示[16]，即需要评估可能由肠道病毒引发的安全隐患。

5 展望

尽管肠道病毒组的重要性受到越来越多的重视，但目前的研究还很不充分，尚有大量科学问题亟待解决。

首先，需要加强肠道病毒组与疾病的相关性研究，更充分地认识肠道病毒组的动态变化。回顾过去十多年在肠道微生物研究中取得的成绩，可以看到以16S rDNA深度测序为代表的技术进步，能够不依赖体外培养快速低成本地鉴定肠道菌群的组成，极大地促进了细菌微生物组研究的快速发展[30]。而全面鉴定肠道中病毒的研究目前还存在许多困难，一是病毒的多样性和序列高度变异性；二是病毒核酸所占比例较小，在纯化和扩增病毒相关序列时很容易引入额外偏差；三是目前的建库和测序方法在检测RNA病毒方面尤其不足，而RNA病毒对人体健康有重要影响[31]。此外，测序得到的有可能是全新的病毒，其序列无法和数据库中的已知病毒匹配[32]，因此病毒数据库建设也需要加强，汇总收录更多的病毒序列信息。不断改进的建库、测序、分析方法和病毒数据库将有助于我们更好地认识肠道病毒在其他疾病中可能发挥的作用。

其次，需要加强对肠道病毒组的功能研究。肠道细菌的分离培养技术已经取得了长足的进步，据估计人类肠道中超过70%的细菌可以通过不同条件的培养基分离培养，为进一步研究肠道微生物功能奠定了基础[33-35]。目前可以针对某一类宿主筛选病毒，比如针对艰难梭菌感染筛选得到的裂解性噬菌体有望用于耐药菌的治疗[36]。不过考虑到病毒感染的宿主特异性，大规模培养病毒更加困难，目前还没有对病毒进行大规模培养的报道。Yang等利用利巴韦林等广谱抗病毒成分(Anti-virus component，AVC)清除肠道病毒，研究干扰肠道病毒后对宿主的影响[37]。不过这种方法缺少特异性，不足以确定具体是哪种病毒发挥了作用。值得注意的是，目前研究中广泛使用的SPF小鼠缺少自然环境下的共生的肠道菌群和肠道病毒，导致SPF小鼠有着与自然状态下不同的免疫反应[38]。今后的研究中应当充分考虑不同肠道菌群和肠道病毒对宿主的影响。

随着大规模测序数据的大量积累，通过生物信息学方法从数据库中挖掘新病毒信息，并且寻找特定功能基因的策略将发挥重要作用。随着已经解析结构的蛋白数量不断积累，通过人工智能方法根据氨基酸序列来预测蛋白结构的准确率不断提高[39]，使得根据蛋白相似性预测病毒-宿主间的相互作用关系成为可能。Lasso等开发了一个计算框架，基于结构的相似性来预测病原体-宿主相互作用(P-HIPSTer)，根据结构信息预测2.82万例病毒蛋白和人类蛋白相互作用，通过实验验证率为76%，显示了很高的准确率[40]。这一方法也有一系列新的发现，比如通过预测蛋白-蛋白相互作用来区分具有高或低致癌潜力的人乳头瘤病毒(HPV)[40]，也为研究难以培养的病毒功能提供了思路。

在现代分子生物学发展的早期阶段，许多重大发现都是基于噬菌体研究获得的。病毒学研究还发展出许多强有力的研究工具，大大推动了生物学的研究发展。比如2018年诺贝尔化学奖一半授予了美国科学家G.P.Smith和英国科学家G.P.Winter爵士，以表彰其“用于肽和抗体的噬菌体展示”。作为细菌抗病毒免疫反应的CRISPR-Cas9系统，为基因操作提供了强有力的工具[41]。对肠道病毒组的进一步深入研究，或许也能给我们带来意想不到的惊喜。