辣根过氧化物酶-金属有机骨架纳米纤维复合物生物传感器的制备及其用于食品中过氧化氢残留检测的研究

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(1.宁波大学食品与药学学院,浙江宁波 315211; 2.上海大学生命科学学院,上海 200444; 3.中科院宁波材料技术与工程研究所,浙江宁波 315201)

近年来,食品安全问题越来越受到人们的关注。过氧化氢作为抗菌剂、氧化还原剂以及漂白剂等被广泛应用于临床治疗、生物和食品加工等各个领域[1]。在国内,过氧化氢作为食品加工助剂,在食品加工过程中被广泛使用。美国食品药品监督管理局将过氧化氢列为“一般公认安全添加剂”,但最大添加量有明确规定,且在食品加工生产中,过氧化氢残留需要通过适当的物理或化学方法去除[2]。由于过氧化氢应用广泛,监查难度大,如不规范使用,会导致食品中过氧化氢超标。过氧化氢进入人体后不仅会损坏人体细胞,最终加速人体衰老甚至诱发心血管疾病,对人体中枢神经造成不可逆损害,诱发像阿尔兹海默症、癌症等一系列老化相关疾病，最终对人体健康带来危害[3-4]。因此急需开发一种快速高效检测过氧化氢的方法。

目前,虽然检测过氧化氢有许多方法,如传统的滴定法[5]、荧光分光光度法[6]、紫外分光光度法[7]、纸片法[8-9]以及色谱法等[10],但是传统的方法相对于生物传感器来说灵敏度不够高,需要昂贵的仪器,复杂的操作,专业的操作人员,严格的实验环境,以及无法实现现场快速检测等。生物传感器尤其是酶电化学传感器具有高选择性、高灵敏度、易小型化的特点,可以实现原位实时检测从而获得了更多关注。生物传感器的商业进程一直备受限制,其主要原因是以酶为活性识别单元的传感器容易受环境影响导致其活性及稳定性降低。因此,发展新的固定化平台来提升酶对环境的稳定性是实现酶传感器商业化的重要研究内容[11]。

辣根过氧化物酶是一种含有铁卟啉辅基的糖蛋白复合酶,是当前研究最广泛的一种过氧化物酶。在过氧化氢存在的情况下,辣根过氧化物酶能够催化氧化多种化合物,特别是含有大(共轭体系的物质,如酚类、芳香类、苯胺类、吲哚等化合物[12]。金属骨架材料(MOFs)是有机-无机杂化多孔材料,是一类由变价金属、p区金属元素、碱土金属、锕系元素等金属离子,与可调控的有机链像羧酸类、胺类、硝酸盐、磷酸盐、磺酸盐类等,配位而成[13-15]。MOFs具有超高的孔隙率,最大可以达到6000 m2/g的比表面积,可以调节的形态以及孔径大小,多样的功能化可修饰性,非常适合用于酶的固定化[16-18]。MOFs固定化酶研制电化学传感器对于酶电化学传感器性能发展提供了一个新的方向,故本研究合成了一种高稳定性的金属骨架纳米纤维(MONFs),通过物理吸附将辣根过氧化物酶固定化于金属骨架纳米纤维,并利用壳聚糖凝胶作为成膜剂,构筑了辣根过氧化酶-金属骨架纳米纤维传感器并用于过氧化氢的检测。检测过程中使用的对苯二酚具有电化学可逆性、稳定性及快速的电子传导能力,同时较低的氧化还原电位也有利于电化学检测,是一种非常优良的电子传递体[19]。利用对苯二酚作为电子传递体,采用循环伏安法研究所构筑酶传感器的电化学特性和稳定性,采用电流-时间法研究了酶传感器的选择性、线性关系及检测范围,本研究为食品中过氧化氢的残留检测提供新方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

辣根过氧化物酶(HRP,活性大于250 U mg-1) 美国Sigma公司;过氧化氢溶液、对苯二酚、壳聚糖(Chit,脱乙酰化95%)、氯化钾、天冬氨酸、乙酸 阿拉丁试剂(上海)有限公司;六水硫酸铜、氯化钠、氯化钾、氢氧化钠、铁氰化钾、亚铁氰化钾 国药集团化学试剂有限公司;0.1mol/L的磷酸缓冲溶液(PBS,pH7.5)由磷酸二氢钠和磷酸二氢钾配制被用作电解液,所有的水溶液由新鲜的超纯水(18 MΩ·cm)制备;鸡爪 当地农贸市场;牛奶盒装 250 mL,伊利纯牛奶,当地超市;所有化学药品 均为分析纯。

D8 Discover XRD粉末X射线衍射仪(XRD) 德国布鲁克公司;S-4800扫描电子显微镜(SEM) 日本日立公司;TG16-WS台式离心机 上海卢湘仪离心机公司;MITR-YXQM-0.4L行星式球磨机 长沙米淇仪器设备有限公司;XSE105分析天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;BCD102小冰箱 深圳先科电器有限公司;800Y高速多功能粉碎机 永康市铂欧五金制品有限公司;采用上海辰华CHI760E电化学工作站三电极体系进行电化学测试,工作电极和辅助电极分别为玻碳电极和铂丝电极,饱和甘汞电极(SCE)作参比电极。

1.2 实验方法

1.2.1 金属骨架纳米纤维的合成与表征 在室温下,将6 mL六水硫酸铜水溶液(4.5 mmol/L)加到30 mL含有氢氧化钠(6 mmol/L)与天冬氨酸(3 mmol/L)的混合溶液中,溶液迅速变为蓝色,常温搅拌2 h,生成深蓝色絮状物。使用1∶1的水和乙醇分别洗涤和离心6次,转速为8000 r/min,10 min。80 ℃真空干燥10 h,用球磨机磨成均匀的粉末颗粒,提高在水溶液中的分散性[20]。

MONFs的结晶性由XRD粉末衍射进行分析,辐射源为Cu靶Ka射线(λ=1.5406 Å),电压为40 kV,电流为40 mA,扫描范围为2°～40°,测试在室温下进行。MONFs的形貌分析通过场发射电子扫描显微镜观察,冷场发射枪,电压为10 kV。

1.2.2 辣根过氧化物酶-金属有机骨架纳米纤维生物传感器的制备 构筑HRP-MONFs/Chit/GCE电化学传感器过程通过示意图1表示,使用不同粒径的氧化铝打磨玻碳电极(GCE,3mm),分别用乙醇和水超声清洗三次,氮气吹干;将10 μL辣根过氧化物酶(10 mg/mL)溶液加入20 μL MONFs(5 mg/mL)水溶液中混合,在低温、200 r/min条件下摇床10 h;加入10 μL壳聚糖溶液(6 mg/mL,pH6.0),震荡3 min。将5 μL混合溶液滴涂在电极表面,电极低温晾干后,4 ℃储存在0.05 mol/L PBS(pH7.5)中。

图1 辣根过氧化物酶-金属有机骨架 纳米纤维生物传感器示意图Fig.1 Schematic illustrations for HRP-MONFs/Chit/GCE

1.2.3 辣根过氧化物酶-金属有机骨架纳米纤维生物传感器的电化学测试

1.2.3.1 阻抗分析 在含有5.0 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-的0.1 mol/L KCl溶液中,对不同电极进行电化学阻抗分析,电压为开路电压,频率范围为0.1～105Hz,振幅5 mV,阻抗数据通过ZVIEW软件进行拟合。

1.2.3.2 循环伏安特性分析 酶电极在0.1 mol/L磷酸缓冲液、0.1 mol/L含有1.0 mmol/L对苯二酚的磷酸缓冲液、0.1 mol/L含有1.0 mmol/L对苯二酚和0.1 mmol/L过氧化氢的磷酸缓冲液进行循环伏安法分析,电压范围相对于参比电极(饱和甘汞电极SCE)为-0.8～0.8 V。使用含有0.1 mmol/L H2O2和1 mmol/L对苯二酚的0.1 mol/L PBS(pH7.5)溶液作为过氧化氢检测体系溶液,使用不同修饰程度的壳聚糖电极(Chit/GCE)、MOFs修饰电极(MONFs/Chit/GCE)及MONFs固定化酶电极(HRP-MONFs/Chit/GCE)进行循环伏安法分析,扫描速度为50 mV·s-1,电压范围相对于参比电极(饱和甘汞电极SCE)为-0.8～0.8 V。

1.2.3.3 酶电极电化学行为分析与优化 使用含有0.1 mmol/L H2O2和1 mmol/L对苯二酚的0.1 mol/L PBS(pH7.5)溶液作为过氧化氢检测体系溶液,HRP-MONFs/Chit/GCE酶电极使用不同扫描速度进行循环伏安分析,扫描速度范围为50～400 mV·s-1,电压范围为-0.8～0.8 V。电解液的pH和MONFs量的优化依据循环伏安法测定的酶电极还原峰的峰值电流进行分析,电解液pH范围为6.0～8.0,MONFs量为1～10 mg/mL,电解液为含有0.1 mmol/L H2O2和1 mmol/L对苯二酚的0.1 mol/L PBS溶液。

1.2.3.4 构建校准曲线 采用安培电流-时间方法来建立酶电极电流信号对过氧化氢浓度的校准曲线,检测实施在10 mL被搅拌的0.1 mol/L PBS(pH7.5),应用峰值电位为-0.1V。采用安培电流-时间方法来建立酶电极电流信号对过氧化氢浓度的校准曲线,添加的过氧化氢浓度为12.5、25、50、62.5、125 μmol/L,每次添加量为25 μL。

1.2.3.5 检测鸡爪和牛奶中的过氧化氢残留 鸡爪的可食部分通过高速多功能粉碎机(34000 r/min)粉碎均匀,称取10 g(精确到0.01g),加适量水溶解,转移入100 mL容量瓶中,摇匀,浸泡40 min,用滤纸过滤,滤液作为试样液备用。鸡爪试样液和牛奶原液利用酶电极通过安培电流-时间法测试是否含有过氧化氢,然后添加过氧化氢并配制成不同过氧化氢浓度(12.5、50和125 μmol/L H2O2)的牛奶测试溶液和鸡爪提取溶液,每种过氧化氢浓度样品至少三个平行,通过安培电流-时间法测试酶电极的回收率。

1.2.3.6 酶传感器稳定性和选择性分析 酶电极稳定性通过使用酶电极在最优条件下,对过氧化氢反应体系(含有0.1 mmol/L H2O2和1 mmol/L对苯二酚的0.1 mol/L PBS,pH7.5)进行循环伏安检测,计算30 d内电流信号的变化。酶传感器的选择性评估是在10 mL被搅拌的0.1 mol/L PBS(pH7.5)中进行电流-时间曲线测试,分别添加25 μL 100 μmol/L的过氧化氢、葡萄糖、尿素、柠檬酸溶液,应用电位为-0.1 V。

1.3 数据处理

阻抗数据通过ZVIEW软件拟合分析得到。使用相对标准偏差分析检测结果的精密度,相对标准偏差(RSD)=标准偏差(SD)/计算结果的算术平均值(X)×100%。

2 结果与分析

2.1 合成的MONFs表征

图2A为MONFs的XRD图。MONFs在2θ=10.93°、14.85°、19.88°、24.75°、26.32°和28.65°具有较强的衍射峰,材料具有高结晶性。SEM形貌分析显示MONFs拥有均一、规则的几何构型,为200 nm宽度,10 μm长度的纤维状结构(图2B)。根据前期工作的研究,该MONFs在200 ℃以下具有很好的结构稳定性[20];另外,MONFs使用了天冬氨酸作为配体有机链,MONFs表面含有丰富的羧酸基团,具有好的生物兼容性,提供了很好的平台来固定化辣根过氧化物[20]。

图2 MONFs的结构表征图Fig.2 Structural characterization of MONFs注:XRD(A);SEM(B)。

2.2 辣根过氧化物酶-金属有机骨架纳米纤维生物传感器的制备

为了表述电极装备过程,使用了电化学阻抗法(EIS)测试了不同电极的表界面性质。图3为裸玻碳电极(GCE)、Chit/GCE、MONFs/Chit/GCE及HRP-MONFs/Chit/GCE的奈奎斯特图,通过等效电路图拟合得到,裸玻碳电极阻抗值为55 Ω,代表了裸电极界面[Fe(CN)6]3-/4-传荷过程控制的电极阻抗;当电极修饰上壳聚糖后,Rct为75 Ω,界面阻抗有所增加,但阻抗值增加很小,表明壳聚糖作为成膜剂,具有很好的电子传递能力;MONFs/Chit/GCE因为修饰的MOFs所具有的特殊的表面性质和复杂的孔道网络结构,改变了表界面性质,阻抗增加到1.7 kΩ,固定化上HRP后酶电极(HRP-MONFs/Chit/GCE)阻抗增加到5.4 kΩ,表明了HRP成功的固定化;增长的阻抗值主要是因为导电性差的酶分子对界面电子的传递位阻、静电相互作用。不同电极阻抗值的增加体现了电极的不断修饰过程。

图3 不同电极的奈奎斯特图Fig.3 Nyquist plot of different electrodes注:a.裸玻碳电极(GCE);b.Chit/GCE; c.MONFs/Chit/GCE;d.HRP-MONFs/Chit/GCE。

2.3 酶电极的循环伏安特性

HRP-MONFs/Chit/GCE如图4中a线所示,在循环伏安法扫描测试中只有还原峰,而无明显氧化峰,为不可逆反应,且随着扫描次数的增加,酶催化活性逐步消失,这是因为酶的活性中心电子传导能力弱,不能及时恢复活力。如b线所示,添加对苯二酚作为氧化还原中间传递体后,在较低电位下有可逆的氧化与还原峰,构筑了一个完整的氧化还原反应体系[3]。添加0.1 mmol/L过氧化氢后,酶电极对过氧化氢有敏感变化,在-0.1V有明显的还原峰的增大,因酶催化过氧化氢的还原,形成更多的氧化态的酶,如图1所示,反应体系中的对苯二酚还原了酶的氧化态,使酶的活性恢复,生成了更多的对苯醌,造成了对苯二酚的还原峰的急剧增加,通过定量测定对苯醌还原电位的电化学电流,来定量检测过氧化氢浓度变化[19]。

图4 HRP-MONFs/Chit/GCE 在不同检测溶液中的循环伏安图Fig.4 CV curves of HRP-MONFs/Chit/GCE cycled in different detection solution注:a:0.1 mol/L磷酸缓冲液;b:0.1 mol/L含有1.0 mmol/L对苯二酚的磷酸缓冲液;c:0.1 mol/L含有1.0 mmol/L对苯二酚以及0.1 mmol/L过氧化氢的磷酸缓冲液。

通过采用0.1 mol/L PBS与1 mmol/L HQ(对苯二酚)及0.1 mmol/L的H2O2的电化学反应体系,从图5可以看出:MONFs/Chit/GCE虽然具有更高的阻抗值,但氧化还原峰相比于Chit/GCE更大,体现了MONFs很好的底物浓度聚集能力。Chit/GCE与MONFs/Chit/GCE氧化峰与还原峰峰值电流相同,峰值电位无变化,表明对过氧化氢无催化效果,而HRP-MONFs/Chit/GCE在-0.1V的还原峰明显增大,氧化峰明显减小,且峰位电流发生了偏转,表现了酶对过氧化氢明显的特异性催化效果,导致了对苯醌还原电流的变化。所制备的HRP-MONFs/Chit/GCE具有很好的对过氧化氢的催化能力。

图5 不同电极在过氧化氢检测溶液中的循环伏安图Fig.5 CV of different electrodes in detection solution containing H2O2注:a：Chit/GCE;b：MONFs/Chit/GCE; c:HRP-MONFs/Chit/GCE。

2.4 酶电极电化学行为与优化

如图6所示,酶电极为工作电极,以不同扫描速度进行循环伏安扫描,可以看出峰电位基本不变,峰电流随着扫描速度增加而增加。从图7所示,峰值电流随扫描速度从50～400 mVs-1成线性增加。表明了该反应体系中,酶电极为受扩散传质控制的反应过程,界面反应速度受传质速度的影响,传质控制方式与其他使用电子传递中间体传递电子的酶传感器报道相同[21]。

图6 HRP-MONFs/Chit/GCE在不同扫速下的循环伏安图Fig.6 CV curves of HRP-MONFs/Chit/ GCE at different scan rates

图7 HRP-MONFs/Chit/GCE不同扫速下 峰值电流与扫速关系图Fig.7 Plot of cathodic and anodic peak current for HRP-MONFs/Chit/GCE versus scan rateat different scan rates

酶传感器的性能优化通过调节电解液的pH及MONFs量来进行。因为酶的活性易受环境pH的影响,所以电解液pH对酶电极的能力有很大影响。从图8可以看出,酶电极的峰值电流从pH5.5开始增长,在pH7.5达到最大值,在pH8处峰值电流降低。另外,固定化HRP的量受到MONFs量的影响很大,从含有不同浓度MONFs以及相同浓度HRP的不同酶电极CV峰值电流变化图9中可以看出峰值电流在2 mg/mL MONFs处取得最大值,酶与MONFs的比率为5∶2,表明在该浓度下,在该比率下,固定化酶的量达到最大,因此2 mg/mL的MONFs和 PBS(pH7.5)被用于酶电极的制备以及在反应体系的分析。

图8 底物溶液pH对HRP-MONFs/ Chit/GCE峰值电流的影响Fig.8 Effects of PBS buffer's pH on the cathodic peak current of HRP-MONFs/Chit/GCE

图9 MONFs浓度对HRP-MONFs/ Chit/GCE峰值电流的影响Fig.9 Effects of concentrations of MONFs on the cathodic peak current of HRP-MONFs/Chit/GCE

2.5 酶电极构建校准曲线

电流-时间的曲线方法作为恒电压电化学分析方法,通过使用酶电极检测加入一系列不同浓度的过氧化氢,电流的变化,来构建电流校准曲线。图10为在-0.1 V的反应电位下,不断添加过氧化氢到PBS溶液中酶电极的电流变化,可以看出HRP-MONFs/Chit/GCE对过氧化氢具有很好的响应性,产生阶跃电流,且在3 s内达到95%稳定状态电流。图11为HRP-MONFs/Chit/GCE相应的校准曲线,响应电流具有很好的线性关系,线性范围为12.5～675 μmol/L,线性回归方程为Y=0.02271X + 0.96919(R2=0.999)。另外,HRP-MONFs/Chit/GCE有一个很低的检测线为0.97 μmol/L,基于3 S/N。

图10 HRP-MONFs/Chit/GCE对H2O2响应I-T曲线Fig.10 Amperometric responses of HRP-MONFs/Chit/GCE upon successive additions of H2O2

图11 电流响应与H2O2浓度校准曲线Fig.11 Calibration curve of amperometric responses at different H2O2 concentrations

2.6 辣根过氧化物酶-金属有机骨架纳米纤维生物传感器在食品中实际应用

目前的工作选用鸡爪和牛奶作为固态食品和液态食品的代表来研究该酶传感器在食品中的应用。添加牛奶和鸡爪空白溶液,HRP-MONFs/Chit/GCE均未有明显响应,呈过氧化氢阴性。表1为随着添加带有12.5、25、50 μmol/L过氧化氢浓度的牛奶和鸡爪提取液,HRP-MONFs/Chit/GCE测得的样品浓度的回收率。对于在鸡爪和牛奶样品中不同浓度的H2O2,回收率范围为94%～107%。结果表明,该构建的传感器是非常稳定和准确地定量检测食品中过氧化氢的工具,具有进一步应用的潜质。

2.7 酶传感器的稳定性与选择性

从图12可以看出,HRP-MONFs/Chit/GCE不使用时,储存在0.05 mol/L PBS、4 ℃条件下,在24 d,HRP-MONFs/Chit/GCE能够保持其初始94%左右的性能,HRP-MONFs/Chit/GCE表现了较好的储存稳定性和操作稳定性。在0.1 mol/L PBS(pH7.5)中进行电流-时间曲线测试,分别添加同等浓度100 μmol/L的过氧化氢、葡萄糖、尿素、柠檬酸溶液(图13),在50 s时添加25 μL过氧化氢溶液,电流从-2.1 μA阶跃至-10.2 μA,并在3 s内达到稳定状态,该传感器对过氧化氢具有快速的反应能力,而加入同样体积的干扰物,电流并没有发生明显变化,说明添加物均无干扰,该传感器具有较好的选择性。

表1 牛奶和鸡爪样品中过氧化氢测定(n=3)Table 1 Determination of hydrogen peroxide in milk and chicken feet solution(n=3)

图12 HRP-MONFs/Chit/GCE储存稳定性变化图Fig.12 Storage stability of HRP-MONFs/Chit/GCE

图13 HRP-MONFs/Chit/GCE选择性测试曲线Fig.13 Selectivity test of HRP-MONFs/Chit/GCE

3 结论

本研究合成了一种新型HRP固定化材料,制备了电化学酶传感器检测食品中的过氧化氢。合成的金属骨架纳米纤维具有较好的生物兼容性且HRP与金属骨架纳米纤维取得了较好的固定化效果;制备的酶传感器对过氧化氢具有较好的电催化能力,通过检测电化学媒介体对苯醌还原电流的变化,建立了快速灵敏检测过氧化氢含量变化的电化学定量方法。该传感器在12.5～675 μmol/L范围有较好的线性范围,最低检测限为0.97 μmol/L,有较高的稳定性和选择性,且成功的应用于检测食品中过氧化氢残留(固态食品和液态食品)。