梅花鹿鹿茸片及近源品种真伪鉴别

李明月，王倩雯，石瑶，张敏

(锦州医科大学畜牧兽医学院，辽宁锦州121001 )

鹿茸是一种传统的动物性中药材，鹿茸具有养血的功效，还具有壮元阳，补肾，补气血，抗衰老的作用，在中国具有特殊的意义，是古代帝王的象征。我国劳动人民的生活水平逐步的提高对鹿茸等的以往的奢侈品的需求量也是逐年的增加，鹿茸已经成为一种常用药。

鹿茸是指雄鹿的未骨化的多毛的幼角，药用的时候是从顶端慢慢向下切的一种半透明、角质样、无蜂窝状小孔的饮片。在《中华人民共和国药典》的2000年版终只规定了产于东北三省和河北等地的梅花鹿和马鹿是地道的正品药材。最近几年价格低而且质量次的新西兰鹿茸，冒充我国的梅花鹿鹿茸和马鹿茸占领市场，尤其是其切片茸等初加工品冒充现象更为严重，即使在双阳，四丰等梅花鹿的主要产地、产区，各大城市的一些名牌参茸经销店也毫不例外， 影响我国正品鹿茸的国际市场的销售，阻碍了我国的养殖业的健全成长。更应引起注意的是这些冒牌产品在我国药典中是绝不允许，也是我国养鹿界和医疗保健界近年一直反对的。

市场上的含有部分或者微量鹿茸成分的丸剂、散剂及原生药，利用传统的方法很难鉴定其真伪，利用PCR技术不仅对整个鹿茸、鹿茸片、破碎的鹿茸进行准确的鉴定，而且对这种丸剂，散剂可以进行有效的真伪鉴定，对其纯度大小的检查与质量好坏评定。生物科学技术的发展，使得从DNA分子水平鉴定近源的中药材已经成为育种全新的准确而快捷的中药材鉴定手段，发展成为一门学科成为分子生药学，主要是对生药的DNA 分子进行鉴定内容的学科。

在巨大的利益的驱使下，梅花鹿鹿茸的混淆品和近源伪品越来越多。它在很大程度上制约了中医的现代化、规范化和国际化发展。 药剂鉴定与质量评价工作越来越棘手，其真伪鉴定具有重要的现实意义。通过生物学技术鉴定打破了中药常规鉴定的界限, DNA分子遗传标记不仅可以准确地鉴别中成药中的微量生药成份还可以从种或种以下水平进行近缘种的准确鉴定，不受组织或药材部位对鉴定的影响，因而对于准确、合理、安全用药、保障患者的权益具有重要意义。 鹿产品采用DNA分子遗传标记技术鉴定，取样量少避免了样品的损耗，可以直接从动物样本中采集样品，这样不会导致整个样本的破坏，并且具有自己的特殊亮点。 在该研究中，可以通过设计引物来鉴定同源鹿茸。而且不用测序达到即准确快捷又节省成本，利于实行。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验样品从吉林农业大学参茸中心获取的梅花鹿鹿茸和新西兰鹿的鹿茸。样品数量：梅花鹿茸片10个，新西兰鹿的茸片10个。

1.2 试验方法

1.2.1 总DNA的提取。首先用70%的酒精对鹿茸片进行清洗，时间是3min之后放在烘箱中温度控制在37℃，让其中的酒精尽快的挥发，否则影响DNA的提取结果。按照常规的酚/氯仿进行DNA 的提取，稀释为50ng/μL，-20℃保存备用。

1.2.2 PCR扩增。PCR扩增反应所用引物：上游引物 5′-TACTGCCGCTGACGTATTACG-3′。下游引物 5′-GATGGCTCTGGCAACGCGCT-3′。PCR扩增反应物组成：总DNA模板是50ng/μL,加2μL；2.5mM的 dNTP 加2μL ；rTaq聚合酶0.2μL；10×PCR Buffer 加2μL ；特异性引物各10pm/μL，加各加1μL；,加灭菌的去离子水16.8μL。试验反应参数：94℃ 9min,94℃,53.2℃ 1min,72℃ 50s ,30个循环，72℃ 10min,PCR仪中进行扩增。

1.2.3 电泳及观察分析。利用1%的琼脂糖检测PCR扩增的结果，在UVP凝胶图像分析系统上观察并记录结果。

2 结果

PCR鉴定的结果：从图1看出梅花鹿和新西兰鹿具有明显的区分性。

图1 依次为1是阴性对照，新西兰(2～3)，梅花鹿(4～6)

3 讨论与结果

新西兰鹿茸现在是鹿产品中主要的近源伪品，利用新西兰鹿角，新西兰鞭，新西兰鹿胎来冒充正品的梅花鹿的角、鞭和梅花鹿胎给消费者带来亏损。

在本试验中利用特异性的引物采用PCR方法扩增梅花鹿及其近源品种新西兰鹿的鹿茸总DNA，只需通过PCR分析条带的差别就能特异性地鉴别出鉴别出新西兰和梅花鹿的鹿茸及其制剂。在高度严谨的PCR扩增条件下二种鹿具有明显的条带的区别,且结果稳定而不需要序列的测定，防止传统的鉴别的方法的周期长，价格偏高的弊端，采用此方法方便迅速在同样的试验条件下对梅花鹿和新西兰鹿茸的样本的总DNA进行PCR扩增，其结果在条带个数之间存在显著的区别。

在阴性对照上且没有出现条带，实验结果是确实靠的住的。新西兰鹿茸(2～3)与梅花鹿茸(4～6)在500bp～250bp， 梅花鹿茸扩增具有3个条带，鹿茸最明显的区别是在500bp～250bp， 新西兰鹿茸的扩增结果有二条明显的条带，两种样品各具有自己特异的条带数目。本实验结果对梅花鹿的鹿茸片剂混淆品和代用品新西兰鹿的鉴别具有重要的意义，对现实中伪品的鉴别提供的重要参考价值。